Kerja eksperimen mengenai pemindahan keratinosit alogenik ke parut tikus putih yang dicipta secara buatan

Keinginan untuk menggunakan potensi selular dan keperluan untuk mencari kaedah baru yang berkesan untuk memperbaiki penampilan estetik parut membawa kepada idea untuk cuba mengkaji kemungkinan pemindahan keratinosit ke permukaan parut.

Untuk membuktikan kebarangkalian menggunakan kultur keratinosit untuk memperbaiki penampilan parut, kajian eksperimen telah dijalankan ke atas tikus makmal putih, yang mana permukaan parut dicipta. Model parut tikus diperoleh hasil daripada penyembuhan luka buatan di bahagian belakang, di sepanjang tulang belakang. Tikus telah dipotong kulit yang sama, bersaiz 2x3 cm. 2.5 bulan selepas operasi "pemodelan parut", tikus menjalani dermabrasion (penyingkiran lapisan atas parut menggunakan thermocaustic) dan keratinosit alogenik dipindahkan, diasingkan daripada kulit anak tikus 2-4 hari selepas kelahiran.

Pengasingan dan penanaman sel epidermis tikus telah dijalankan di makmal teknologi sel Institut Sitologi Akademi Sains Rusia menggunakan teknologi berikut.

Kulit dibasuh dalam larutan garam Hank yang mengandungi 200 U/ml gentamicin dan dipotong menjadi kepingan kecil, 0.2-0.5 cm2 dalam kawasan ^. Kepingan kulit telah diinkubasi dalam larutan dispase 0.5% dalam larutan garam fosfat-buffer seimbang pada suhu 37°C selama 1 jam. Kepingan itu kemudiannya dipindahkan ke garam penimbal fosfat Dulbecco dan epidermis dipisahkan daripada dermis. Epidermis diinkubasi dalam larutan trypsin 0.125% selama 10-15 minit dengan kacau pada 50 rpm, selepas itu tindakan enzim dihentikan dengan menambah 5% serum lembu janin. Satu pertiga daripada penggantungan sel yang terhasil digunakan dalam bentuk tulen untuk salah satu pilihan untuk pemindahan pada parut, yang ketiga kedua ditanam pada salutan filem domestik biokompatibel "Polypor", dan yang ketiga - pada hidangan Petri tanpa substrat. Operasi dermabrasion pada parut yang terhasil pada tikus dengan pemindahan sel epidermis tikus ke atasnya dilakukan di bawah bius eter menggunakan kauter terma.

Dalam kumpulan pertama tikus, selepas dermabrasion, kepingan kambrik steril diletakkan pada digilap, dibasuh dengan larutan fisiologi dan permukaan kering parut, di mana penggantungan goncang epidermosit tikus alogenik digunakan pada kepekatan 1.5 juta sel setiap 1 ml (menurut Institut Sitologi). Potongan kambrik diletakkan pada parut yang digilap supaya sel-sel itu terletak di permukaan parut. Pembalut beberapa lapisan kain kasa diletakkan di atas, yang dijahit ke tepi parut.

Sebahagian daripada penggantungan sel yang diperoleh telah disemai dalam piring Petri pada filem Polypore steril yang dipotong mengikut bentuk hidangan, bahagian lain - pada piring Petri tanpa filem. Penanaman dijalankan dalam medium FAD, terdiri daripada campuran medium DMEM dan F12 dalam nisbah 3:1. dengan tambahan 10% serum lembu janin, 5 μg / ml insulin (Sigma), 0.5 μg / ml hidrokortison hemisuccinate (Sigma). 10 μg / ml faktor pertumbuhan epidermis EGF (Institut Cytology RAS, St. Petersburg). Kumpulan kedua dan ketiga tikus, 7 individu setiap satu, telah dibedah pada 6 hari selepas yang pertama. Pada masa ini, lapisan berbilang lapisan telah terbentuk daripada penggantungan keratinosit berbiji dalam hidangan Petri, yang dipindahkan ke dalam tikus. Kumpulan kedua dipindahkan dengan epidermosit pada filem, yang ketiga - dengan lapisan berbilang lapisan tanpa substrat. Selepas 7 hari, lapisan multilayer keratinosit alogenik (MPALK) yang diperolehi, yang disemai pada filem "Polypore", telah dipindahkan sebagai budaya terus ke permukaan luka. Di bahagian atas, filem itu, untuk mengelakkan koyaknya, diikat dengan pembalut kasa berbilang lapisan dan dijahit pada kulit tikus.

Sebelum memindahkan keratinosit kepada kumpulan ketiga tikus yang ditanam tanpa substrat, PAC telah dipisahkan dari bahagian bawah piring Petri dengan merawatnya dengan dispase, yang mempunyai keupayaan untuk secara selektif mengganggu ikatan dermal-epidermis. Apabila bertindak pada lapisan berbilang lapisan, dispase mengganggu sambungan sel lapisan basal dengan bahagian bawah cawan Petri dan mempunyai kesan yang lebih rendah pada sambungan antara sel, yang memungkinkan untuk "mengalih keluar" lapisan sepenuhnya. Detasmen lapisan sel berbilang lapis dengan dispase telah dijalankan seperti berikut. Medium pengangkutan disalirkan dari piring Petri, lapisan sel dibasuh tiga kali dengan medium nutrien yang mengandungi antibiotik, khususnya, gentamicin (0.2 mg/ml). Lapisan berbilang lapis diisi dengan larutan dispase 0.125% ("Sigma") dan diletakkan dalam termostat, di mana ia diinkubasi pada t=37°C selama 20-30 minit. Kemunculan rim putih yang mengelupas di sepanjang pinggir lapisan adalah penunjuk permulaan proses pemisahannya dari tepi dan bahagian bawah piring Petri. Beberapa minit selepas permulaan proses pemisahan, larutan dispase dikeringkan, lapisan epitelium dibasuh 2-3 kali dengan medium. Sekeping pembalut luka steril "Lita-color" yang dipotong mengikut saiz cawan telah digunakan pada permukaan lapisan epidermis, di mana lapisan yang dipisahkan dengan dispase, tambahan yang dikupas dari bahagian bawah cawan dengan spatula, telah tersekat. Menggunakan pinset mata, lapisan bersama dengan salutan serbet "Lita-color" (Rusia) dikoyakkan dari bahagian bawah piring Petri dan dipindahkan dengan berhati-hati ke permukaan parut yang disediakan. Napkin "Lita-color" mengandungi gentamicin dan exolin (ekstrak kolagen), yang, apabila dibasahkan dengan sisa-sisa medium pertumbuhan dan kemudian dengan penyelesaian fisiologi, membengkak dan menjadi pembalut luka moden, memberikan perlindungan yang baik daripada jangkitan luaran dan penyembuhan pesat disebabkan oleh struktur menyerap lembapan.

Pembalut kasa berbilang lapisan telah digunakan pada filem Polypore dan serbet warna Lita dan dijahit pada kulit tikus untuk penetapan yang lebih kuat. Setiap tikus diletakkan di dalam sangkar yang berasingan untuk mewujudkan keadaan optimum untuk penyelenggaraan dan pengukuhan keratinosit yang dipindahkan. Pembalut tikus di mana ampaian dan lapisan berbilang lapisan epidermosit yang dibuang secara dispase dipindahkan telah dilembapkan dengan garam steril beberapa kali sehari untuk mewujudkan keadaan yang paling sesuai untuk pengukiran sel. Memandangkan filem Polypore tidak telap air, pembalut tikus dalam kumpulan kedua tidak dibasahi, yang merupakan salah satu kelebihan berbanding pemindahan tanpa filem. Pembalut dikeluarkan selepas 10 hari. Gambar klinikal parut selepas pemindahan sel berbeza sedikit daripada parut tanpa pemindahan, kecuali warnanya yang lebih merah jambu (akibat dermabrasion) dan pengelupasan yang lebih besar. Fakta ini menunjukkan bahawa. bahawa sejurus selepas pembalut luka jatuh dengan MPC, tiada perubahan berlaku pada parut.

Mengambil bahan biopsi daripada tikus.

Selepas 1, 2, 5 dan 9 bulan selepas pemindahan keratinosit alogenik tikus ke parut tikus putih yang digilap, bahan diambil untuk pemeriksaan mikroskopik histologi, sitomorfologi dan elektron. Sampel kulit tikus normal dan parut tanpa pemindahan sel diambil sebagai kawalan. Anestesia tikus dilakukan menggunakan anestesia eter.

Selepas anestesia, kepingan tisu parut diambil dari kawasan yang ditanda di mana keratinosit dipindahkan menggunakan penebuk biopsi berdiameter 2 mm dan diletakkan dalam larutan glutaraldehid 2.5% untuk menyediakan bahan untuk pemeriksaan mikroskopik elektron. Kepingan tisu yang diambil untuk pemeriksaan histologi diletakkan dalam larutan formalin neutral 10%, diikuti dengan melepasi alkohol dan dibenamkan dalam parafin, diikuti dengan memotong bahagian ultra-nipis dan melihatnya dalam mikroskop cahaya-optik.

Kawalan I. Kulit tikus biasa.

Untuk melihat perbezaan antara gambar mikroskopik kulit tikus yang diubah parut normal dan parut pada masa-masa tertentu selepas pemindahan MPC, gambar dan penerangan mengenainya ditunjukkan pada semua peringkat kajian ini.

Epidermis kulit normal terdiri daripada 7-9 lapisan sel. Stratum korneum mempunyai ketebalan yang sederhana. Di beberapa tempat ia terdiri daripada 6-8 lapisan sisik tanduk. Lapisan basal diwakili oleh sel silinder dengan nukleus besar, ringan, berbentuk biasa dan beberapa nukleolus. Sambungan desmosomal antara sel dan dengan membran basal dinyatakan dengan jelas. Di bawah membran basal yang jelas, yang mempunyai pertumbuhan kecil dalam lapisan subepidermis, selari dengannya terletak berkas kolagen dan serat elastin yang halus, antaranya ialah fibroblas memanjang, saluran kecil. Dalam lapisan yang lebih dalam, berkas kolagen dan serat elastin terletak dalam arah yang berbeza. Antaranya adalah banyak kapal dengan dinding nipis berkaliber yang sama, unsur selular (fibroblas, sel mast, leukosit). Sebilangan besar folikel rambut, kelenjar sebum.

Kawalan 2. Parut tikus, berumur 2 bulan.

Gambar klinikal. Parut berwarna merah jambu pucat, dengan mengelupas, kerak kekal di tempat. Kawasan mereka telah berkurangan kerana penguncupan gentian kolagen dan telah menjadi lebih kurang 3.0-3.5 cm ^:. Pelengkap kulit tiada.

Gambar mikroskopik. Epidermis terdiri daripada 3-5 lapisan sel, dilipat, diwakili oleh sel basal bulat, satu baris subulat, 1-2 baris berbutir dengan butiran keratohyalin di lapisan atas, terdapat kawasan edema intraselular. Lapisan korneum tidak sekata berubah daripada sangat nipis kepada menebal. Lipatan parut diperhatikan disebabkan oleh (penguncupan) tisu parut. Lipatan menembusi ke lapisan papilari dan mencipta kesan papila. Sempadan antara epidermis dan dermis ialah garis lurus. Membran bawah tanah tidak dikesan di mana-mana. Di bahagian bawah lapisan subepidermal dan lebih dalam terdapat kapal dengan dinding yang tebal dan longgar, banyak yang sepi, dengan stasis. Di sekeliling kapal terdapat pengumpulan makrofaj, fibroblas. Makrofaj mengelilingi eritrosit yang dikeluarkan dari kapilari dan memfagositosisnya. Dalam lapisan yang lebih dangkal terdapat kapilari kecil. Di bawah epidermis, gentian kolagen terletak longgar. Di lapisan parut yang lebih dalam terdapat berkas serat kolagen yang kasar, di antaranya terdapat banyak fibroblas.

Parut tikus sebulan selepas pemindahan keratinosit tikus.

Gambar klinikal. Parut berwarna merah jambu, kawasannya telah berkurangan, terutamanya diameter, dan secara purata 2.5-3 cm ². Rambut dan kelenjar sebum tidak hadir.

Data pemeriksaan mikroskopik bahan yang diperoleh daripada tikus dengan pemindahan MPaLK pada filem dan MPaLK tanpa substrat boleh dikatakan sama. Walau bagaimanapun, secara teknikal semata-mata, bekerja dengan MPaLK tanpa substrat adalah lebih rumit dan teliti daripada ketika menanam MPaLK pada substrat, oleh itu, dalam mengkaji lebih lanjut isu pemindahan keratinosit kepada parut, kami menggunakan kambrik berbilang lapisan sebagai asas untuk pertumbuhan ("substrat").

Gambar mikroskopik. Penebalan epidermis hingga 15-20 lapisan diperhatikan, hampir ke tengahnya keratinosit mempunyai bentuk sempit, memanjang, menegak dan susunan padat. Sel basal terletak dalam garisan yang tidak rata. Nukleus mereka adalah ringan, besar, bulat dengan satu atau dua nukleolus, yang menunjukkan aktiviti sintetik dan proliferatif yang tinggi. Sempadan antara epidermis dan dermis ialah garis lurus. Lapisan spinous berkembang dengan baik, terdiri daripada 3-5 lapisan sel bulat, terdapat sel 2-nukleolar.

Sejurus di bawah membran bawah tanah terdapat berkas nipis gentian kolagen yang terletak padat, selari dengan mereka terdapat sejumlah besar kapal terpencil, gentian kolagen yang lebih dalam adalah lebih kasar, dikumpulkan dalam berkas padat. Banyak fibroblas besar, sel mast (2-3 dalam bidang pandangan), makrofaj, leukosit dan salur kosong, dindingnya longgar, di sekelilingnya terdapat serat kolagen yang terletak longgar. Dalam sesetengah kapal terdapat stasis, diapedesis unsur-unsur yang terbentuk. Di sekeliling kapal terdapat fibroblas, limfosit tunggal. Pelengkap kulit tiada.

Apabila memindahkan suspensi keratinosit ke parut yang digilap, gambar mikroskopik berbeza daripada yang sebelumnya. Dalam kebanyakan haiwan, epidermis adalah nipis dan terdiri daripada 5-6 lapisan sel. Lapisan bawah terdiri daripada sel-sel yang tidak teratur, bentuk poligon dengan nukleus bentuk bulat-tidak teratur. Keadaan lapisan subepidermis adalah serupa dengan keadaannya dalam kumpulan haiwan tanpa pemindahan MPALK.

Dalam kes ini, kita boleh bercakap sama ada tentang kelewatan dalam proses yang mengiringi pemindahan sel, atau tentang kehilangan besar sel yang dipindahkan dalam bentuk penggantungan. Oleh itu, kesimpulan telah dibuat tentang ketidaksesuaian pembetulan parut dengan memindahkan keratinosit dalam bentuk penggantungan.

Parut tikus 2 bulan selepas pemindahan keratinosit tikus.

Gambar klinikal. Parut kelihatan nipis dan halus. Di tempat-tempat, bintik-bintik mengelupas dan bersisik diperhatikan.

Gambar mikroskopik. Stratum korneum menebal, di tempat - hiperkeratosis. Epidermis menebal, terdiri daripada 12-20 baris sel. Sempadan antara epidermis dan dermis ialah garis lurus. Gentian kolagen halus di bawah epidermis terletak agak padat. Dalam lapisan parut yang lebih dalam, ia dikumpulkan dalam berkas kasar yang besar. Dalam lapisan subepidermis, pembentukan vaskular baru muncul. Di lapisan bawah tisu parut, terdapat banyak salur kosong yang terletak selari dengan permukaan epidermis. Fibroblas besar diagihkan sama rata dalam ketebalan parut, terdapat gergasi, bercabang, banyak makrofaj.

Parut tikus 5 bulan selepas pemindahan sel epidermis tikus.

Gambar klinikal. Parut kelihatan sekata, licin tanpa mengelupas, terdapat rambut tunggal, ketumpatannya lebih besar di pinggir parut, yang menunjukkan pertumbuhan kecil folikel rambut ke dalam parut dan pembentukan baru folikel rambut. Kawasan parut terus berkurangan.

Gambar mikroskopik. Epidermis masih tebal (15-20 lapisan, di beberapa tempat sehingga 30) di lapisan atas ia dipenuhi dengan butiran keratohyalin. Membran bawah tanah kelihatan jelas. Di bawahnya, serat kolagen terletak dengan longgar. Di lapisan bawah, kolagen lebih berkuasa dan padat. Terdapat banyak kapilari di antara berkas kolagen. Di lapisan atas, bilangan kapal yang terbiar telah berkurangan. Persimpangan epidermis dan dermis sedikit beralun. Di sesetengah tempat, terdapat pertumbuhan epidermis yang mendalam dalam tisu parut. Pembuluh yang baru terbentuk kelihatan di antara gentian kolagen. Folikel rambut tunggal dan kelenjar sebum muncul.

Parut tikus 9 bulan selepas pemindahan sel MPA epidermis tikus.

Gambar klinikal. Saiz parut telah menjadi lebih kecil dengan ketara berbanding dengan tempoh sebelumnya, kawasannya secara purata kira-kira 1.5-2.0 cm ². Parut tidak sekata ditutup dengan rambut halus, terutamanya di pinggir. Pengelupasan plat halus kecil kekal.

Gambar mikroskopik.

Epidermis telah menjadi lebih nipis, diwakili oleh 6-8 baris sel, menyerupai epidermis kulit tikus normal dalam struktur, hanya ketumpatan sel 1 mm lebih tinggi dan mereka lebih kecil. Lapisan basal terdiri daripada sel silinder bulat kecil. Membran basal dinyatakan dengan baik, hemidesmosom kelihatan jelas. Kehadiran pertumbuhan epidermis dalam lapisan subepidermis diperhatikan. Lapisan papillary dinyatakan sepanjang keseluruhan parut. Fakta ini menunjukkan bahawa pada masa ini lekatan keratinosit yang dipindahkan telah menjadi lebih kuat dengan tisu parut yang mendasarinya. Oleh itu, penjagaan parut pada orang dengan pemindahan MPALK 9 bulan selepas pemindahan MPC boleh dilakukan secara tradisional. Di bawah epidermis, gentian kolagen lebih halus daripada di lapisan dalam. Banyak kapal telah muncul, terutamanya yang dangkal. Dinding kapal yang lebih besar menebal. Folikel rambut dan kelenjar sebum berada dalam kuantiti yang banyak. Gambar mikroskopik menyerupai tisu seperti kulit.

Hasil kerja eksperimen dan perbincangan mereka.

Semasa menjalankan kerja ini, keratinosit dalam pelbagai bentuk telah dipindahkan ke parut kulit tikus yang dicipta secara buatan selepas pembedahan dermabrasion - pada penutup luka, sebagai penggantungan pada kambrik, dan sebagai lapisan berbilang lapisan tanpa substrat. Kerja-kerja ini dijalankan dengan tujuan untuk mendapatkan data morfologi mengenai kesan keratinosit alogenik yang dipindahkan pada parut, serta menentukan pilihan pemindahan yang optimum.

Telah didapati bahawa ketiga-tiga kaedah pemindahan boleh dilaksanakan, tetapi pemindahan MPAC tanpa substrat adalah prosedur yang sangat intensif buruh, di mana MPAC boleh cedera, yang menjejaskan keputusan pemindahan. Selain itu, kaedah pemindahan ini tidak termasuk kerja pada permukaan yang besar.

Pemindahan suspensi keratinosit adalah kaedah yang lebih menjimatkan kos, tidak memerlukan penanaman sel jangka panjang dan mudah dalam versi yang kami cadangkan menggunakan kosong kambrik steril, yang saiznya sepadan dengan saiz parut. Kelewatan dalam kesan terapeutik apabila memindahkan penggantungan sel kira-kira sebulan berbanding MPC pada salutan luka bukanlah titik penting dengan tempoh rawatan selama beberapa bulan. Adalah diketahui bahawa apabila MPC dipindahkan untuk membakar pesakit, transformasi struktur kulit berlaku secara beransur-ansur dan selama beberapa tahun. Pemindahan budaya keratinosit pada salutan luka adalah kaedah yang paling mudah dan menjanjikan, tetapi juga jauh lebih mahal. Di samping itu, pada masa ini ia memerlukan carian untuk pilihan salutan yang lebih maju yang seharusnya fleksibel, higroskopik, mempunyai sifat bakteriostatik atau bakteria dan neutral secara biologi untuk sel. Filem "Polypor" - versi perantaraan penutup luka filem domestik, walaupun terdapat beberapa ketidaksempurnaan, membolehkan kami mengkaji dalam eksperimen pemindahan keratinosit tikus pada parut dan membuat kesimpulan tentang keberkesanan arah rawatan parut ini.

Penulis yang memindahkan MPC ke luka terbakar menyatakan bahawa pada minggu pertama selepas memindahkan lapisan keratinosit berbilang lapisan ke luka yang telah dibersihkan, epidermis menebal dan berstrata. Semua lapisan epidermis kelihatan jelas. Menariknya, bilangan lapisan sel dalam pemindahan adalah 10-30% lebih besar daripada biopsi kulit. Penulis mencatatkan kemunculan butiran keratohyalin pada hari ke-5 selepas pemindahan MPC, dan membran basal dan hemidesmosomes - sudah pada hari ke-3.

J.Rives et al. (1994), Paramonov BA (1996); Kuznetsov NM et al. (1998) mendapati bahawa pada peringkat awal selepas pemindahan MPC kepada pesakit yang mengalami kecacatan kulit setebal penuh selepas terbakar, hubungan antara dermis dan epidermis adalah sangat lemah dan merupakan garis lurus, lapisan papilari tidak hadir. Menjelang akhir bulan ke-2, papila cetek dan pelengkap kulit mula terbentuk, sambungan antara dermis dan epidermis menjadi lebih kuat. Data kesusasteraan menunjukkan bahawa pemindahan keratinosit alogenik ke luka pada pesakit terbakar adalah kaedah yang menjanjikan. Walaupun fakta bahawa penolakan keratinosit alogenik berlaku, menurut pengarang yang berbeza, dalam tempoh 10 hari hingga 3 bulan, mereka tetap memainkan peranan mereka dalam menyembuhkan permukaan luka, merembeskan faktor pertumbuhan dan menutup kecacatan secara mekanikal. Adalah dipercayai bahawa MPALC telah mengurangkan aktiviti antigen, kerana semasa penanaman in vitro mereka kehilangan sel Langerhans, yang membolehkan mereka wujud dalam badan penerima untuk masa yang lama. Di samping itu, budaya alogenik yang diperoleh daripada kulit orang muda yang sihat mempunyai potensi biologi yang tidak dapat dibandingkan dengan budaya autologus pesakit selepas kecederaan.

Matlamat utama kajian kami adalah untuk mengetahui sama ada keratinosit alogenik akan berakar pada parut dan apakah perubahan yang akan berlaku pada tisu parut di bawah pengaruh "salutan luka" yang aktif secara biologi. Sekiranya keputusan positif, untuk membangunkan teknologi yang paling berkesan dan paling tidak berintensif buruh untuk bidang perubatan pemulihan ini.

Data yang kami perolehi dalam banyak cara serupa dengan data literatur mengenai perubahan morfologi yang berlaku dalam epidermis manusia selepas pemindahan keratinosit alogenik untuk membakar luka. Walau bagaimanapun, terdapat juga perbezaan yang ketara, baik dari segi substrat morfologi di mana pemindahan berlaku dan dari segi teknologi. Oleh itu, proses pembentukan membran bawah tanah dan sambungan dermal-epidermis (hemidesmosomes, papillae) berlaku pada peringkat kemudian berbanding dengan pemindahan keratinosit ke permukaan luka tanpa perubahan cicatricial. Nampaknya, ini berlaku kerana pemakanan tisu parut yang lebih lemah berbanding dengan dermis atau fascia otot. Parut, terutamanya yang lama, adalah tisu penghubung yang padat dengan jumlah salur yang sangat kecil, manakala bahagian bawah luka terbakar adalah tisu granulasi yang kaya dengan salur. Oleh itu, adalah jelas bahawa keadaan di mana pemindahan dan pengukuhan keratinosit berlaku adalah sama sekali berbeza. Lebih banyak vaskularisasi kawasan pemindahan sel, lebih mudah proses engraftment mereka. Dari postulat ini mengikuti kesimpulan tentang keutamaan bekerja dengan parut muda, di mana tisu penghubung masih agak longgar dan kaya dengan kapal.

Hasil daripada kerja eksperimen ini terbukti bahawa:

1. Pemindahan MPALK pada parut adalah mungkin.
2. Kaedah pemindahan yang optimum ialah pemindahan keratinosit pada penutup luka.
3. Permukaan parut hendaklah digilap menggunakan dermabrasion laser pembedahan atau pemotong Schumann.
4. Di bawah pengaruh MPALK, epitelialisasi pantas permukaan parut yang digilap berlaku.
5. Lebih baik vaskularisasi tisu parut, iaitu, lebih muda parut, lebih baik hasil pemindahan keratinosit.
6. Di bawah pengaruh keratinosit yang dipindahkan, tisu parut secara beransur-ansur berubah dan bertukar menjadi seperti dermal (tisu parut yang lebih longgar dengan pelengkap kulit).
7. Kelonggaran tisu parut secara beransur-ansur, bermula dengan lapisan subepidermis. Vaskularisasinya bertambah baik, berkas serat kolagen di bahagian atas dan bawah parut mengambil susunan yang lebih longgar berbanding tisu parut tanpa pemindahan sel. Folikel rambut dan kelenjar sebum muncul. Epidermis, dalam strukturnya, setelah melepasi fasa hipertrofi, menghampiri epidermis kulit normal.
8. Perubahan yang diperhatikan dikaitkan dengan faktor pertumbuhan dan sitokin yang dirembeskan oleh keratinosit, yang, dengan meningkatkan trofisme tisu parut, menggalakkan transformasinya daripada tisu berserabut kasar kepada tisu yang lebih longgar, yang membawa kepada peningkatan dalam penampilan parut.

Oleh itu, berdasarkan kajian ini, dapat disimpulkan bahawa keratinosit yang dipindahkan mempunyai kesan yang baik terhadap tisu parut, yang mungkin mempunyai implikasi praktikal untuk pemulihan pesakit dengan pelbagai jenis parut.

Kerja mengenai tikus ini juga membolehkan kami merumuskan keperluan untuk penutup luka di mana keratinosit ditanam.

Pembalut luka hendaklah:

• biokompatibel dengan sel,
• bernafas,
• mempunyai asas yang elastik, membentuk bentuk,
• menjadi hidrofilik,
• sebagai bahan tambahan perubatan mengandungi ubat antibakteria dan antioksida yang tidak toksik kepada sel kultur.

Keputusan klinikal rawatan bioteknologi parut.

Sebelum ini, N. Carver et al. (1993) mendapati bahawa pembalut oklusif paling baik menggalakkan perlekatan pada luka dan kemandirian keratinosit, tetapi tidak membenarkan pembentukan epidermis berstrata (matang). Persekitaran udara diperlukan untuk pembentukan epidermis berstrata. Oleh itu, selepas melekatkan lapisan berbilang lapisan, adalah dicadangkan untuk mengeluarkan pembalut luka oklusif selepas 7-10 hari dan merawat luka di bawah pembalut kering atau salap larut air. Boleh dikatakan bahawa kualiti dan sifat "substrat" di mana sel-sel tumbuh adalah titik yang sangat penting untuk keberkesanan pemindahan bahan selular, dan oleh itu untuk hasil kerja doktor. Tetapi tidak ada pembalut luka yang ideal hari ini, walaupun terdapat banyak pilihan yang dicadangkan (kulit tiruan, kain bukan tenunan yang diperbuat daripada selulosa karboksimetil, salutan fibrin, filem poliuretana separa telap). Perkara penting dalam perkara ini ialah kos "substrat" (penutup luka khas), kerana kosnya yang tinggi meningkatkan kos keseluruhan rawatan bioteknologi.

Keberkesanan teknologi sel telah terbukti sehingga kini, tetapi, malangnya, teknologi ini sangat mahal, terutamanya di negara-negara di mana pengeluaran industri komposisi sel belum ditubuhkan. Walau bagaimanapun, negara seperti Amerika Syarikat telah lama menubuhkan industri untuk pengeluaran bahan sel untuk pemindahan luka bakar. Khususnya, syarikat BioSurface Technology Inc., sejak 1989, telah mengembangkan 37,000 lapisan keratinosit berbilang lapisan, yang digunakan untuk merawat 240 pesakit di 79 negara di seluruh dunia (R. Odessey, 1992), manakala 1 cm 2 kultur ^sel berharga kira-kira 7-8 dolar AS.

Teknologi untuk merawat pelbagai penyakit dan masalah kulit mempunyai beberapa perbezaan, tetapi sebarang rawatan sel adalah berdasarkan mendapatkan bahan sel berkualiti tinggi dan pemindahannya.

Proses ini terdiri daripada langkah-langkah berikut:

• mengambil kulit daripada mangsa (atau daripada penderma),
• mengangkut flap kulit ke pusat bioteknologi,
• pengasingan sel lapisan basal dan percambahannya,
• pertumbuhan lapisan keratinosit berbilang lapisan (MLK).
• pemindahan kultur sel.

Masalah utama dalam menjalankan rawatan menggunakan pemindahan helaian keratinosit berlapis-lapis adalah keperluan untuk sel berdaya maju pada semua peringkat pemindahan sel. Kepingan kulit untuk mengasingkan sel autologous atau allogeneic harus nipis yang mungkin, kerana dalam kes ini ia lebih mudah untuk dipisahkan menggunakan kaedah mekanikal dan enzimatik dan mendapatkan penggantungan sel hidup untuk penanaman. Ia boleh didapati dengan memotong dengan dermatom atau menggunakan kulit kelopak mata, kulup, dan permukaan dalaman bahu. Memandangkan sel sensitif kepada halogen (klorin, iodin), hidrogen peroksida, ia tidak boleh digunakan semasa memproses kulit semasa pengumpulan bahan.

Hasil kuantitatif dan kualitatif sel daripada cantuman kulit dan kecekapan penanamannya juga bergantung pada kesihatan dan umur penderma. Di samping itu, biopsi kulit mesti dihantar secepat mungkin dan di bawah keadaan yang sesuai (persekitaran, suhu) ke makmal yang diperakui dan diakreditasi untuk tujuan ini.

Untuk penyimpanan dan pengangkutan kepak kulit, medium atau medium Eagle 199 dengan tambahan 10% serum lembu, medium DMEM dengan tambahan 5% serum lembu janin dan antibiotik boleh digunakan.

Di makmal sitologi, biopsi kulit mula-mula dibahagikan secara mekanikal kepada kepingan kecil, kemudian kepingan kulit diproses menggunakan enzim: trypsin, kolagenase, dispase, dll.

Di bawah tindakan enzim, desmosom dimusnahkan dan keratinosit dilepaskan ke dalam medium dalam bentuk sel individu atau agregat yang terdiri daripada bilangan sel yang berbeza. Hanya keratinosit basal yang digunakan untuk penanaman, yang ditanam pada media khas dalam termostat yang mengandungi 5% CO, dalam hidangan Petri atau dalam kelalang pada t = 37 ° C. Sudah selepas 48 jam, pembentukan koloni keratinosit diperhatikan, yang secara beransur-ansur bergabung untuk berubah menjadi monolayer. Selepas menerima bilangan sel yang mencukupi, penggantungan yang terhasil disemai pada pembalut luka yang disediakan untuk tujuan ini dan diletakkan dalam piring Petri. Pertama, lapisan tunggal dan kemudian lapisan keratinosit berbilang lapisan terbentuk daripada penggantungan. Peringkat-peringkat proses penanaman keratinosit secara skematik ditunjukkan dalam Rajah 12 (33,43,54,65).

Pembentukan lapisan keratinosit berbilang lapisan yang sesuai untuk pemindahan biasanya mengambil masa 7-10 hari. Kadangkala tempoh ini lebih lama, yang bergantung pada kualiti bahan sumber (umur, keadaan kesihatan penderma, ketepatan pengumpulan bahan, kualiti media yang digunakan, dll.). Jika lapisan multilayer terlalu besar, maka sel-sel dengan fenomena apoptosis yang tidak sesuai untuk pemindahan mungkin muncul di permukaannya. Piring petri dengan lapisan keratinosit berbilang lapisan (MLK) yang tumbuh di dalamnya pada penutup luka dihantar ke klinik dalam bekas khas pada suhu sekurang-kurangnya +15° C.

Kaedah Ubahsuai Hijau untuk Menanam MPC

Dalam kerja kami, kami menggunakan kambrik berbilang lapisan sebagai penutup luka, meninggalkan filem "Polypor" yang kami mula bekerja dalam eksperimen dengan tikus. Oleh itu, kami mengembangkan lapisan keratinosit berbilang lapisan pada kambrik pra-nyah lemak dan steril, walaupun ia juga bukan penutup luka yang optimum.

Kajian klinikal telah dijalankan ke atas sukarelawan dengan mematuhi piawaian etika yang diperlukan: menandatangani perjanjian dan persetujuan termaklum.

1. Budaya keratinosit sendiri (autolog) dan berbank (allogeneik) telah digunakan.
2. Keratinosit pesakit sendiri diperoleh daripada sekeping kulit yang dipotong dari bahagian dalam lengan atas mereka.
3. Pembedahan dermabrasion parut dilakukan menggunakan thermocautery, cakera berputar dan laser erbium.
4. Kumpulan pesakit dengan parut normotrophic, hypotrophic dan hypertrophic telah diambil.

Proses teknologi untuk aplikasi teknologi selular untuk memperbaiki penampilan parut kulit terdiri daripada peringkat berikut:

1. Pemilihan pesakit.
2. Penjelasan tentang intipati rawatan, jangka masa untuk mendapatkan hasil yang diharapkan, menandatangani kontrak dan persetujuan termaklum.
3. Menetapkan kepada pesakit 2-3 minggu sebelum pembedahan selmevit 1 tablet 3 kali sehari, zinctheral 1 tablet 3 kali sehari.
4. Mengambil sekeping kulit 2.0 cm panjang dan 0.7-1.0 cm lebar dari permukaan dalaman bahu, tinggi, hampir di bahagian bawah kawasan axillary untuk mendapatkan keratinosit autologous.
5. Dalam kes di mana pesakit enggan mengasingkan keratinosit mereka sendiri kerana kemungkinan parut linear pada permukaan dalaman bahu, bahan selular diambil dari bank sel (keratinosit alogenik).
6. Keratinosit telah diasingkan dan ditanam di makmal yang diperakui untuk jenis kerja ini.
7. Selepas mendapatkan jumlah MPC yang mencukupi untuk pemindahan pada parut, satu hari ditetapkan untuk pembedahan di klinik, di mana bahan itu dibawa dalam bekas khas dalam piring Petri.
8. Operasi dermabrasion parut dilakukan, hemostasis, permukaan yang digilap dibasuh dengan larutan garam steril, dikeringkan, selepas itu MPC dipindahkan ke atasnya pada "sel bawah" kambrik steril. Iaitu, sel-sel yang berada di atas dalam MPC ternyata lebih rendah, bersebelahan dengan permukaan yang digilap.
9. Filem steril digunakan di atas, yang dipasang pada kulit dengan pembalut elastik atau plaster Omnifix elastik. Daripada filem, pembalut luka acuh tak acuh yang mengandungi silikon boleh digunakan, contohnya Mepitel, Mepiform, kepingan gel silikon.

Selepas 5-7 hari, salutan filem atau silikon dikeluarkan. Pada masa ini, semua keratinosit sepatutnya telah merangkak ke parut yang digilap dan melekat pada permukaannya.

10. Persekitaran lembap yang dicipta di bawah salutan filem dan silikon secara aktif menyumbang kepada ini. Kambrik yang tinggal pada parut dari titik ini boleh direndam dengan curiosin atau gel kitosan. Akibatnya, pada hari ke-2 kerak padat dicipta, yang, untuk kemudahan pesakit, paling baik diperbaiki dengan tampalan elastik, bernafas, seperti Omnifix. Kerak bernafas membolehkan epidermis yang terbentuk untuk membezakan dan bertukar menjadi yang matang.

Bergantung pada jenis parut dan kedalaman pengisaran, pembalut ditolak selepas 8-10 hari. Pada masa ini, epidermis mempunyai 30-40% lebih banyak lapisan sel berbanding kulit biasa. Membran bawah tanah tidak terbentuk. Keratinosit daripada epidermis yang menebal merembeskan banyak molekul aktif secara biologi ke dalam tisu parut.

Kejayaan rawatan parut bioteknologi sebahagian besarnya bergantung kepada kaedah penjagaan dalam tempoh selepas operasi. Kultur sel ialah sejenis penutup luka yang "lembut" dan pada peringkat awal selepas pemindahan, IPC boleh dikupas dengan mudah dari tisu di bawahnya. Oleh itu, pesakit dinasihatkan untuk mengendalikan parut dengan berhati-hati selepas pembedahan. Selama 8-9 bulan, jangan gosok dan rawat perlahan-lahan dengan air masak sejuk untuk mengelakkan koyak epidermis nipis yang baru dicipta, yang tidak mempunyai ikatan yang ketat dengan tisu di bawahnya.

Nota.

Sebelum pembedahan dan semasa dermabrasion, penggunaan antiseptik dan pengoksida halogen (iodopyrone, suliodopyrone, iodinol, iodinate, chlorhexidine, hidrogen peroksida) adalah dibenarkan, sebelum pemindahan sel - adalah dilarang keras kerana kesan sitotoksiknya. Biru metilena dan hijau cemerlang juga toksik kepada sel.

Untuk mengelakkan jangkitan, terutamanya apabila bekerja dengan parut hipertropik, medan pembedahan boleh dirawat dengan neomycin sulfate, polymyxin atau gentamicin. Mereka tidak mempunyai kesan sitotoksik pada keratinosit.

Hasil daripada rawatan sedemikian, kesan tiga kali ganda dicapai.

1. Meratakan permukaan parut.
2. Penciptaan lapisan epidermis baru dengan ketebalan normal di atasnya.
3. Transformasi tisu parut kepada tisu seperti dermal disebabkan oleh tindakan sitokin, faktor pertumbuhan dan molekul aktif biologi lain yang dirembeskan oleh sel yang dipindahkan dan dirangsang oleh mereka keratinosit, fibroblas dan makrofaj.

Parut menjadi kurang ketara, lebih elastik, pori-pori dan rambut vellus muncul di dalamnya, dan pigmentasi boleh dipulihkan kerana kehadiran melanosit dalam IPC.

Walau bagaimanapun, semua aspek positif parut ini tidak berlaku serta-merta. Dalam hal ini, adalah perlu untuk memberi amaran kepada pesakit bahawa proses transformasi tisu parut ke dalam tisu dermis berlaku secara perlahan dan hasil optimum rawatan sedemikian boleh dijangka tidak lebih awal daripada dalam 10-14 bulan. Sejurus selepas penolakan pembalut, permukaan yang digilap mempunyai polikromi yang jelas, semakin cerah semakin dalam penggilapan dilakukan. Kerosakan paling sedikit pada kulit diperhatikan apabila menggilap parut normotropik dengan laser erbium. Warna parut dan kulit sekeliling dipulihkan dalam masa 3 hingga 8 minggu. Walaupun langkah berjaga-jaga sedemikian, hiperpigmentasi pasca operasi kadang-kadang berlaku, yang boleh hilang dengan sendirinya dalam beberapa bulan.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ]