Nyamuk dengan 'perisai genetik' terbina dalam menghentikan malaria - kadar jangkitan menurun sebanyak 93%

Mengatasi rintangan racun serangga: Bagaimana satu pengubahsuaian gen dalam nyamuk membiak sendiri merentas generasi, hampir menghapuskan penularan malaria tanpa menjejaskan kemandirian.

Dalam kajian yang diterbitkan baru-baru ini dalam Nature, sepasukan saintis meneliti sama ada alel glutamin 224 (Q224) dalam protein berkaitan fibrinogen 1 (FREP1) menjadikan nyamuk Anopheles stephensi tahan terhadap jangkitan Plasmodium, menganggarkan kos kelangsungan hidup yang dikaitkan dengan alel ini, dan menguji pemacu gen mutasi allelik ini untuk menyebarkan populasi gen pelindung ini.

Prasyarat

Kira-kira 600,000 orang mati akibat malaria pada 2023, kebanyakannya kanak-kanak di sub-Sahara Afrika dan Asia Selatan. Kaedah kawalan tradisional - kelambu, rawatan racun serangga, ubat antimalaria - kehilangan keberkesanannya kerana rintangan nyamuk dan parasit. Teknologi pemacu gen yang menyebarkan alel bermanfaat melalui populasi nyamuk menawarkan penyelesaian yang menjanjikan dan mampan.

Protein FREP1 membantu parasit melintasi usus tengah nyamuk, tetapi varian semula jadi Q224 boleh menghalang jangkitan tanpa menjejaskan biologi nyamuk. Matlamatnya adalah untuk menguji sama ada alel endogen sedemikian boleh diedarkan dengan selamat untuk mengurangkan penghantaran malaria sambil mengekalkan daya maju nyamuk.

Mengenai kajian

Menggunakan CRISPR/Cas9, dua strain Anopheles stephensi telah dicipta yang hanya berbeza dalam asid amino ke-224 dalam protein FREP1: jenis liar dengan leucine (L224) dan strain berpotensi pelindung dengan glutamin (Q224). RNA panduan menyasarkan kawasan intron 126 bp hulu kodon, membolehkan penggabungan semula homolog dengan penyisipan label pendarfluor (GFP atau RFP).

Kecergasan dinilai oleh panjang sayap, kesuburan, kebolehtetasan telur, kepompong, kemunculan dewasa, dan jangka hayat (analisis survival Kaplan-Meier).

Kecekapan vektor ditentukan menggunakan penyuapan membran standard Plasmodium falciparum (manusia) dan Plasmodium berghei (roden) parasit, dengan kiraan ookista dan sporozoit dalam kelenjar air liur.

Sistem pemacu alel termasuk kaset dengan gRNA terhadap L224 dan Cas9 di bawah kawalan promoter vasa. Frekuensi alel dipantau menggunakan tag pendarfluor dalam eksperimen berbilang kitaran (10 generasi). Genotyping dilakukan menggunakan PCR, penjujukan Sanger, dan NGS. Pemodelan Bayesian menganggarkan penukaran alel, kos kecergasan dan dinamik semasa mengawan percuma di makmal.

Keputusan

Alel FREP1Q224 tidak menyebabkan kerugian yang ketara dalam kelangsungan hidup: panjang sayap, kesuburan, penetasan, pupation, dan kemunculan dewasa adalah sama dengan kawalan FREP1L224. Perbezaan kecil dalam saiz dan jangka hayat lelaki tidak menjejaskan daya saing. Betina FREP1Q224 dara hidup selagi terkawal, dan betina selepas penyusuan darah menunjukkan hanya sedikit penurunan dalam jangka hayat.

Eksperimen cabaran mendedahkan perlindungan yang ketara dalam homozigot.

• Pada kepekatan rendah gametosit P. falciparum (0.08%):
  • Kadar jangkitan menurun daripada 80% kepada ~30% dalam FREP1Q224;
  • Purata bilangan ookista: dari 3 hingga 0;
  • Sporozoit dalam kelenjar air liur: dari >4000 hingga 0.
• Pada gametocythemia yang lebih tinggi (0.15%):
  • Purata bilangan ookista: dari ~32 hingga
  • Sporozoit juga menurun secara mendadak.
• Untuk P. berghei:
  • Purata bilangan ookista: dari 43 hingga 25;
  • Sporozoit: dari ~19,000 hingga 11,000.
• Heterozigot (FREP1L224/Q224) tidak dilindungi.

Kecekapan pemacu gen

• Dalam persilangan berpasangan, Cas9 + gRNA L224 menukarkan 50 hingga 86% daripada alel FREP1L224 kepada FREP1Q224;
• Dengan Cas9 ibu, kekerapannya lebih tinggi;
• Pada generasi ke-2, kekerapan alel pelindung mencapai 93%;
• Insiden ralat laluan pembaikan NHEJ adalah rendah (0–12%) dan biasanya menyebabkan kerosakan.
• Dalam populasi sel dengan nisbah penderma:penerima 1:3, kekerapan FREP1Q224 meningkat daripada 25% kepada >90% dalam tempoh 10 generasi;
• Kekerapan alel NHEJ jatuh daripada 5.4% kepada

Pemodelan Bayesian menyokong hipotesis penukaran tinggi, frekuensi rendah mutasi stabil dan kesan mozek steril yang mematikan, di mana homozigot WT dengan genotip Cas9 ibu mengalami mutasi somatik dan mengurangkan kelangsungan hidup.

Generasi kemudian menunjukkan penindasan hampir lengkap ookista P. falciparum (median 0 hingga 5.5), mengesahkan bahawa populasi telah menjadi sebahagian besarnya refraktori kepada penghantaran parasit.

Alel pelindung tidak mempunyai faedah tersembunyi atau kesan sampingan, dan disebarkan melalui pemanduan.

Kesimpulan

Kajian itu mendapati bahawa menggantikan asid amino tunggal dalam protein FREP1 dan mengalihkan warisannya menggunakan pemacu gen boleh menjadikan Anopheles stephensi hampir kebal terhadap malaria - kedua-dua manusia dan tikus - tanpa menjejaskan daya maju nyamuk.

Pendekatan ini melengkapkan langkah-langkah sedia ada (jaring, racun serangga, ubat-ubatan) yang keberkesanannya dikurangkan oleh rintangan. Sistem sedemikian juga boleh digunakan untuk memulihkan sensitiviti terhadap racun serangga atau memperkenalkan alel pelindung lain.

Sebelum teknologi boleh dilaksanakan, rangka kerja alam sekitar, etika dan tadbir urus yang ketat, serta sistem untuk mengawal penyebaran, diperlukan.