Terapi gen bukan virus menawarkan harapan untuk sakit pinggang kronik

Dalam kajian terbaru yang diterbitkan dalam jurnal Biomaterials, penyelidik membangunkan terapi gen bukan virus novel untuk merawat sakit belakang diskogenik (DBP) dengan menyampaikan faktor transkripsi Forkhead Box F1 (FOXF1) menggunakan vesikel ekstraselular kejuruteraan (eEV) ke dalam cakera intervertebral degeneratif (IVD) dalam vivo.

Sakit pinggang kronik (LBP) adalah masalah global yang semakin meningkat disebabkan oleh populasi yang semakin tua dan masalah opioid yang semakin teruk. Rawatan semasa termasuk bantuan jangka pendek atau pembedahan yang mahal, menonjolkan keperluan untuk terapi tidak ketagihan dan kurang invasif.

Pendekatan biologi semasa, termasuk pentadbiran faktor pertumbuhan, terapi sel, dan terapi gen virus, boleh mengurangkan kemerosotan dalam model haiwan dan manusia. Walau bagaimanapun, isu-isu seperti kesan jangka pendek, keberkesanan jangka panjang yang lemah, dan imunogenisiti dan onkogenisiti yang tidak perlu boleh menghalang penggunaan langsung pendekatan ini.

Dalam kajian ini, para penyelidik menubuhkan terapi gen bukan virus untuk degenerasi cakera intervertebral (IVD) menggunakan FOXF1-eEV.

Para penyelidik mengalihkan fibroblas embrionik tetikus primer (PMEF) dengan plasmid yang mengandungi FOXF1 atau pCMV6 sebagai kawalan dan sampel eEV yang dicirikan menggunakan ujian pengesanan nanopartikel (NTA).

Mereka menilai pemuatan kargo molekul yang cekap ke dalam eEV menggunakan tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (qRT-PCR) dan PCR konvensional. Analisis Western blot mengenal pasti protein khusus FOXF1 dan EV dalam pembentukan eEV. Pasukan ini menggunakan plasmid yang meningkatkan kawasan polylinker atas dan bawah untuk menentukan kehadiran DNA plasmid FOXF1 dalam sel penderma dan menghasilkan eEV.

Mereka memeriksa mRNA penuh yang dihasilkan daripada DNA plasmid dalam eEV dan sel penderma.

Penyelidik mencipta vesikel ekstraselular dengan faktor transkripsi untuk memulihkan fungsi tisu dan mengubah tindak balas kesakitan dalam model haiwan DBP.

Mereka mengenal pasti EV untuk pengangkutan dan pengedaran FOXF1 ke dalam cakera intervertebral yang rosak dalam model tetikus sakit belakang diskogenik untuk menentukan perencatan FOXF1 eEV terhadap degenerasi cakera intervertebral.

Pasukan itu menggabungkan ujian biomekanik cakera intervertebral tetikus dengan pengimejan, perubahan matriks ekstraselular (ECM), dan tindak balas kesakitan yang dinilai selepas 12 minggu untuk mengesahkan perubahan dalam struktur dan fungsi, serta kesakitan, yang disebabkan oleh campur tangan terapeutik.

Penilaian kesakitan pra operasi dan pasca operasi termasuk tomografi mikro-dikira (mikro-CT), pengimejan resonans magnetik (MRI), ujian mekanikal, pewarnaan biru Alcian (AB) dan picrosirius merah (PSR), ujian biru dimetilena, dan imunohistokimia (IHC).

Kajian itu melibatkan teknik pembedahan di mana penyelidik memberikan Buprenorphine ER secara subkutan kepada tikus untuk mengawal kesakitan selepas pembedahan.

Pasukan itu menjalankan penilaian tingkah laku sebelum pembedahan dan setiap dua minggu dari empat hingga 12 minggu selepas pembedahan, menggunakan pelbagai kaedah termasuk ujian medan terbuka, plat sejuk, suspensi ekor dan suspensi wayar.

Ujian lapangan terbuka menilai aktiviti spontan tikus; ujian plat sejuk diukur hiperalgesia haba; ujian penggantungan ekor mengukur kesakitan paksi; dan ujian penggantungan wayar diukur kekuatan.

Dua belas minggu selepas pembedahan, pasukan itu membedah tulang belakang lumbar haiwan menggunakan pengesanan saraf dan arteri femoral untuk mengenal pasti cakera intervertebral antara L4 dan L5, L5 dan L6, dan L6 dan S1 IVD. Mereka menggunakan L5/L6 IVD untuk menilai histologi dan menentukan kandungan glikosaminoglikan (GAG).

FOXF1 eEV mengurangkan tindak balas kesakitan dengan ketara sambil memulihkan struktur dan fungsi IVD, termasuk ketinggian cakera yang lebih baik, penghidratan tisu, kandungan proteoglycan dan sifat mekanikal.

Kajian ini memberi tumpuan kepada pembebasan eEV yang dimuatkan dengan FOXF1 daripada fibroblas primer yang ditransfeksi dengan faktor transkripsi FOXF1. PCR RT kuantitatif menunjukkan peningkatan ketara dalam tahap transkrip mRNA FOXF1 dan tahap mRNA FOXF1 transkripsi penuh panjang berbanding sel yang ditransfeksi pCMV6.

Terapi eEV FOXF1 boleh mengurangkan tindak balas kesakitan dalam model tusukan cakera lumbar pada tikus sehingga 12 minggu. Tikus betina menunjukkan masa sawan yang lebih lama dalam kumpulan yang dirawat FOXF1 berbanding kumpulan yang cedera, yang berlangsung sekurang-kurangnya 12 minggu selepas rawatan.

Terapi FOXF1 eEV meningkatkan penghidratan dan ketinggian tisu IVD dalam haiwan yang cedera dan degeneratif dalam vivo, sambil mengekalkan tahap penghidratan dan keamatan imej berwajaran cakera IVD T2.

Walau bagaimanapun, pasukan itu memerhatikan pengurangan ketinggian cakera pada haiwan dan haiwan yang cedera yang dirawat dengan pCMV6 eEV. Tikus yang dirawat dengan FOXF1 eEV tidak mempunyai pengurangan ketinggian cakera 12 minggu selepas rawatan. Jantina tidak menjejaskan hasil kefungsian.

FOXF1 eEV memulihkan fungsi mekanikal IVD yang rosak dan degenerasi dalam vivo. Di bawah tekanan paksi, IVD yang dirawat FOXF1 eEV menunjukkan kekakuan NZ yang dinormalisasi yang lebih tinggi berbanding IVD yang rosak.

Di bawah keadaan rayapan, IVD yang rosak mempamerkan peningkatan anjakan rayapan yang dinormalkan, menunjukkan penurunan dalam kekakuan anjal rayapan yang dinormalkan.

Keputusan menunjukkan bahawa mengurangkan kandungan GAG dalam IVD yang rosak meningkatkan fleksibiliti mekanikal, tetapi terapi eEV menghalang kehilangan glikosaminoglikan dan perubahan seterusnya dalam fungsi mekanikal.

FOXF1 eEV mendorong perubahan struktur dan fungsi dalam IVD dengan meningkatkan tahap proteoglycan dan GAG.

Hasil kajian menunjukkan bahawa eEV yang sarat dengan faktor transkripsi perkembangan boleh merawat penyakit sendi yang menyakitkan seperti DBP dengan menghantar faktor transkripsi ini ke dalam sendi yang merosot dan menyakitkan oleh IVD.

Strategi ini boleh membantu mengurangkan keabnormalan struktur dan fungsi yang disebabkan oleh penyakit dan mengawal tindak balas kesakitan dalam cara khusus jantina.

Para penyelidik juga mengesyorkan menggunakan faktor transkripsi perkembangan seperti FOXF1 untuk mengalihkan sel NP degeneratif ke dalam keadaan pro-anabolik dalam vivo. Kajian lanjut diperlukan untuk menentukan keberkesanan terapeutiknya.