Terapi gen bukan virus menawarkan harapan untuk sakit pinggang kronik

Dalam kajian terbaru yang diterbitkan dalam Jurnal Biomaterials, penyelidik membangunkan terapi gen bukan virus novel untuk merawat sakit belakang diskogenik (DBP) dengan menyampaikan faktor transkripsi Forkhead Kotak F1 ( FOXF1) menggunakan vesikel ekstraselular kejuruteraan (eEV) ke dalam cakera intervertebral degeneratif (IVD) dalam vivo.

Kronik sakit pinggang (LBP) ialah masalah global yang semakin meningkat akibat populasi yang semakin tua dan masalah opioid yang semakin teruk. Rawatan semasa termasuk bantuan jangka pendek atau pembedahan yang mahal, menonjolkan keperluan untuk terapi yang tidak ketagihan dan kurang invasif.

Terapi biologi semasa, termasuk pentadbiran faktor pertumbuhan, terapi sel dan terapi gen virus, boleh mengurangkan kemerosotan dalam model haiwan dan manusia. Walau bagaimanapun, kebimbangan seperti kesan jangka pendek, keberkesanan jangka panjang yang lemah dan imunogenisiti dan tumorigenisiti yang tidak perlu boleh menghalang penggunaan langsung kaedah ini.

Dalam kajian ini, penyelidik mewujudkan terapi gen bukan virus untuk degenerasi cakera intervertebral (IVD) menggunakan FOXF1-eEV.

Para penyelidik memindahkan fibroblas embrionik tetikus primer (PMEFs) dengan plasmid yang mengandungi FOXF1 atau pCMV6 sebagai kawalan dan mencirikan sampel eEV menggunakan ujian pengesanan zarah nano (NTA).

Mereka menilai pemuatan kargo molekul yang cekap ke dalam eEV menggunakan tindak balas rantai transkripsi-polimerase terbalik kuantitatif (qRT-PCR) dan PCR konvensional. Analisis Western blot mengenal pasti FOXF1 dan protein EV khusus dalam pembentukan eEV. Pasukan ini menggunakan plasmid yang meningkatkan kawasan polilinker hulu dan hilir untuk menentukan kehadiran DNA plasmid FOXF1 dalam sel penderma dan menghasilkan eEV.

Mereka memeriksa mRNA penuh yang dihasilkan daripada DNA plasmid dalam eEV dan sel penderma.

Penyelidik mencipta vesikel ekstraselular dengan faktor transkripsi untuk memulihkan fungsi tisu dan mengubah suai tindak balas kesakitan dalam model haiwan DBP.

Mereka mengenal pasti EV untuk mengangkut dan mengedarkan FOXF1 ke cakera intervertebral yang rosak dalam model tetikus sakit belakang diskogenik untuk menentukan perencatan FOXF1 eEV terhadap degenerasi cakera intervertebral.

Pasukan ini menggabungkan ujian biomekanikal cakera intervertebral tetikus dengan pengimejan, perubahan matriks ekstraselular (ECM) dan tindak balas kesakitan yang dinilai selepas 12 minggu untuk mengesahkan perubahan dalam struktur dan fungsi, serta kesakitan yang disebabkan oleh campur tangan terapeutik.

Penilaian kesakitan praoperasi dan selepas rawatan termasuk tomografi terkomputeran mikro (mikro-CT), pengimejan resonans magnetik (MRI), ujian mekanikal, pewarnaan Alcian blue (AB) dan picrosirius red (PSR), ujian biru dimetilena dan imunohistokimia (IHC). ) ).

Kajian ini melibatkan teknik pembedahan di mana penyelidik menyuntik Buprenorphine ER secara subkutan ke dalam tikus untuk mengawal kesakitan selepas pembedahan.

Pasukan menjalankan penilaian tingkah laku sebelum pembedahan dan setiap dua minggu dari empat hingga dua belas minggu selepas pembedahan, menggunakan pelbagai teknik seperti ujian medan terbuka, plat sejuk, penggantungan ekor dan penggantungan wayar.

Ujian medan terbuka menilai aktiviti spontan tikus; ujian plat sejuk diukur hiperalgesia haba; Ujian penggantungan ekor mengukur kesakitan paksi; dan ujian ampaian wayar mengukur kekuatan.

Dua belas minggu selepas pembedahan, pasukan itu membedah tulang belakang lumbar haiwan itu, menggunakan pengesanan saraf dan arteri femoral untuk mengenal pasti cakera intervertebral antara L4 dan L5, L5 dan L6 serta L6 dan S1 IVD. Mereka menggunakan L5/L6 IVD untuk menilai histologi dan menentukan kandungan glikosaminoglikan (GAG).

EEV FOXF1 dengan ketara mengurangkan tindak balas kesakitan sambil memulihkan struktur dan fungsi IVD, termasuk peningkatan ketinggian cakera, penghidratan tisu, kandungan proteoglikan dan sifat mekanikal.

Kajian ini memfokuskan pada pelepasan eEV yang dimuatkan FOXF1 daripada fibroblas primer yang ditransfeksi dengan faktor transkripsi FOXF1. PCR RT kuantitatif menunjukkan peningkatan ketara dalam tahap transkrip mRNA FOXF1 dan tahap mRNA FOXF1 transkripsi penuh panjang berbanding sel yang ditransfeksi dengan pCMV6.

Terapi FOXF1 eEV boleh mengurangkan tindak balas kesakitan dalam model tetikus tusukan cakera lumbar sehingga 12 minggu. Tikus betina menunjukkan masa pemerolehan yang lebih lama dalam kumpulan yang dirawat FOXF1 berbanding kumpulan yang lesi, yang bertahan selama sekurang-kurangnya 12 minggu selepas rawatan.

Terapi FOXF1 eEV meningkatkan penghidratan dan ketinggian tisu IVD dalam haiwan yang cedera dan degeneratif dalam vivo sambil mengekalkan tahap penghidratan dan keamatan imej IVD berwajaran T2.

Walau bagaimanapun, pasukan memerhatikan penurunan ketinggian cakera pada haiwan yang cedera dan haiwan yang dirawat dengan pCMV6 eEV. Tikus yang dirawat dengan FOXF1 eEV tidak mempunyai pengurangan ketinggian cakera 12 minggu selepas rawatan. Jantina tidak mempengaruhi keputusan berfungsi.

EEV FOXF1 memulihkan fungsi mekanikal IVD yang rosak dan degenerasi dalam vivo. Di bawah tekanan paksi, IVD yang dirawat FOXF1 eEV menunjukkan kekakuan NZ ternormal yang lebih tinggi berbanding IVD yang rosak.

Di bawah keadaan rayapan, IVD yang rosak menunjukkan peningkatan anjakan rayapan yang dinormalkan, menunjukkan penurunan dalam kekakuan keanjalan rayapan yang dinormalkan.

Keputusan menunjukkan bahawa mengurangkan kandungan GAG dalam IVD yang rosak meningkatkan fleksibiliti mekanikal, tetapi terapi eEV menghalang kehilangan glikosaminoglikan dan perubahan seterusnya dalam fungsi mekanikal.

EEV FOXF1 menyebabkan perubahan struktur dan fungsi dalam IVD dengan meningkatkan tahap proteoglikan dan GAG.

Hasil kajian menunjukkan bahawa eEV yang sarat dengan faktor transkripsi perkembangan boleh merawat penyakit sendi yang menyakitkan seperti DBP dengan menghantar faktor transkripsi ini kepada sendi IVD yang merosot dan menyakitkan.

Strategi ini boleh membantu mengurangkan keabnormalan struktur dan fungsi yang disebabkan oleh penyakit itu, serta mengawal tindak balas kesakitan khusus jantina.

Penyelidik juga telah mengesyorkan menggunakan faktor transkripsi perkembangan seperti FOXF1 untuk menukar sel NP degeneratif kepada keadaan pro-anabolik dalam vivo. Kajian lanjut diperlukan untuk menentukan keberkesanan terapeutiknya.