Diagnosis makmal tuberkulosis

Tuberkulosis adalah penyakit yang mudah didiagnosis dalam keadaan moden dan pencapaian saintifik. Diagnosis makmal tuberkulosis adalah pusat kepada kaedah diagnostik lain, kedua hanya untuk penyelidikan sinar-X.

[1], [2], [3], [4],

Ujian darah klinikal

Pada pesakit dengan tuberkulosis, perubahan dalam analisis umum darah tidak patognomonik. Dengan bentuk tuberkulosis yang terhad dan tidak aktif, eritrosit adalah hipokromik dalam kuantiti biasa. Apabila menyusup besar-besaran atau pneumonia caseous, manakala kelaziman lymphadenitis caseous, luka-luka usus tertentu, dan juga untuk pulmonari besar atau pendarahan selepas pembedahan dan komen erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Macrocytosis, dan terutamanya poikilotsitoz bertemu lebih kerap, biasanya dengan anemia teruk. Bilangan reticulocytes pada langkah batuk kering pampasan julat 0,1-0,6%, dengan subcompensated - 0,6-1,0% dan 1% mempunyai ciri-ciri reticulocytes decompensated.

Apabila batuk kering dalam beberapa kes mungkin ada leucocytosis sederhana (sehingga 15 ribu leukosit.), Radiasi Less, yang berlaku dalam 2-7% daripada pesakit dengan bentuk proses yang berlaku terhad dan mudah dan dalam 12.5% - dengan merosakkan dan progresif batuk kering .

Peralihan paling kerap berlaku dalam formula leukosit. Tandai kedua-dua neutrophilia relatif dan mutlak, peralihan sederhana formula leukosit ke kiri sebelum promeletosit. Myelocytes sangat jarang berlaku dalam kes batuk kering yang tidak rumit. Peningkatan jumlah neutrofil dengan granulariti patologi dalam hemogram pesakit dengan tuberkulosis selalu menunjukkan tempoh proses: pada pesakit dengan tuberkulosis yang teruk, hampir semua neutrofil mengandungi butiran patologi. Apabila wabak saraf berhenti, peralihan nuklear agak cepat mendekati normal. Kepuraan patologi neutrofil biasanya lebih lama daripada perubahan lain dalam hemogram.

Kandungan eosinofil dalam darah periferal juga berbeza-beza bergantung kepada fasa proses dan keadaan alah organisma. Bilangan mereka berkurangan sehingga aneozinofiliya dalam wabak yang teruk dan berpanjangan penyakit dan sebaliknya, meningkat apabila menyusup penyerapan dan pengaliran cairan pleural, serta bentuk-bentuk awal batuk kering utama.

Kebanyakan bentuk tuberkulosis utama disertai oleh limfopenia, yang kadang-kadang diperhatikan untuk beberapa tahun, walaupun selepas perubahan parut tertentu. Tuberkulosis sekunder dalam fasa masalah, bergantung kepada keparahan proses, boleh disertai sama ada bilangan limfosit normal, atau limfopenia.

Ia menduduki tempat yang istimewa menentukan kadar pemendapan eritrosit Ujian tambahan untuk menilai proses bersakit paru-paru (ESR) yang mempunyai nilai dalam menilai proses batuk kering aliran dan mengenal pasti bentuk aktif. Peningkatan dalam ESR menunjukkan kehadiran proses patologi (berjangkit-radang, septik bernanah, hemoblastosis, Hodgkin et al.) Dan adalah menunjukkan tahap, tetapi tahap normal tidak ESR selalu menunjukkan ketiadaan patologi. Pecutan pemendapan eritrosit menyumbang kepada peningkatan dalam tahap darah globulins, fibrinogen, kolesterol, dan mengurangkan kelikatan darah. Melambatkan pemendapan erythrocyte adalah ciri-ciri bagi negeri yang disertai dengan hemoconcentration, peningkatan kandungan albumin dan asid hempedu.

Hemogram pada pesakit yang mengalami perubahan tuberkulosis semasa rawatan. Pergeseran hematologik hilang lebih cepat, lebih berjaya intervensi terapeutik. Walau bagaimanapun, seseorang perlu mengingati kesan pada hemopoiesis pelbagai ubat antibakteria. Mereka sering menyebabkan eosinofilia, dalam beberapa kes - leukositosis, dan lebih sering leukopenia sehingga agranulocytosis dan reaksi limfoid-retikular. Kawalan hematologi sistematik dan analisis yang betul terhadap data yang diperolehi adalah penting untuk menilai keadaan klinikal pesakit, dinamik proses dan keberkesanan rawatan yang digunakan.

[5], [6], [7], [8], [9],

Analisis klinikal air kencing

Dengan batuk kering sistem kencing, urinalisis adalah kaedah diagnostik makmal utama. Anda boleh melihat leukocyturia, erythrocyturia, proteinuria, hipoisostenuria, tuberculosis mycobacterium, bakteriuria tidak spesifik.

Leukocyturia adalah gejala yang paling sering berlaku dalam tuberkulosis sistem kencing sebelum kemoterapi spesifik dilakukan dan tidak hadir hanya dalam kes-kes yang luar biasa, contohnya dengan penghapusan lengkap lumen ureter. Ujian Nechyporenko (penentuan jumlah leukosit dalam 1 ml air kencing) membantu lebih objektif menilai nefrotuberkuloze ijazah leukocyturia dengan, dan dalam beberapa kes untuk mengenal pasti ia di kencing normal. Walau bagaimanapun, ia mesti diambil kira bahawa leukositikia boleh berlaku di pyelonephritis akut dan kronik, sistitis, uretritis, batu ginjal dan ureter.

Erythrocyturia. Serta leukocyturia. Dianggap sebagai salah satu daripada tanda-tanda makmal yang paling kerap bagi tuberkulosis sistem genitouriner. Kekerapan hematuria bergantung kepada kelaziman proses, ia meningkat apabila proses tuberkulosis yang merosakkan berkembang di dalam buah pinggang. Erythrocyturia tanpa leukocyturia lebih tipikal untuk peringkat awal tuberkulosis buah pinggang. Hematuria, yang mendominasi leukocyturia, merupakan hujah penting yang memihak kepada tuberkulosis buah pinggang dalam pembezaannya dengan pyelonephritis tidak spesifik.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Ujian darah biokimia

Dengan batuk kering, perubahan dalam beberapa parameter biokimia bergantung terutamanya pada fasa proses, komplikasi dan pelbagai penyakit bersamaan. Pada pesakit dengan batuk kering di paru-paru dan organ-organ lain, jumlah protein dan protein serum darah tidak berubah dan menentukan kandungan normal mereka.

Dalam bentuk penyakit akut, serta dengan peningkatan dan perkembangan bentuk tuberkulosis kronik, pekali albumin-globulin berkurang.

Untuk mengukur atau menilai negeri fungsi kerosakan organik dan hati dalam batuk kering dan komplikasinya adalah penentuan jumlah serum dan bilirubin langsung, AST (ACT), alanine aminotransferase (ALT). Penentuan dinamik tahap aminotransferases. Bilirubin dalam rawatan pesakit tuberkulosis, terutamanya dalam bentuk yang teruk, adalah komponen wajib pemeriksaan biokimia pesakit tuberkulosis dan dilakukan secara bulanan.

Penilaian keadaan berfungsi buah pinggang termasuk penentuan kreatinin serum dan pengiraan kadar penapisan glomerulus mengikut formula Cockcroft-Gault. Pengiraan kadar penapisan glomerular menggunakan sampel Reberg memberikan hasil yang kurang tepat.

Matlamat utama kajian biokimia yang dinamik bagi pesakit tuberkulosis adalah untuk memantau proses, pengesanan kesan sampingan ubat-ubatan dan pembetulan yang mencukupi terhadap timbulnya gangguan kardostatik.

[17], [18], [19]

Penggunaan kaedah penyiasatan biokimia dalam batuk kering ekstrapulmonari

Penunjuk yang paling bermaklumat adalah kandungan asid tuberculostearic dalam cecair biologi, tetapi takrifnya dikaitkan dengan kesulitan teknikal (keperluan untuk kromatografi gas dan spektrometri massa).

Pengukuran prospektif aktiviti adenosin deaminase - enzim, ditentukan dalam cecair: sinovial, pericardial, ascitic atau spinal. Pengeluar utama adenosine deaminase adalah limfosit dan monosit. Penentuan aktiviti adenosine deaminase dalam cecair biologi memudahkan diagnosis sinovitis tuberkulosis, tuberkulosis nodus limfa, meningitis tuberkulosis, serositis tuberkulosis.

Beberapa penunjuk biokimia disebabkan oleh ketidakpastian mereka hanya ditentukan dalam cecair biologi, dekat dengan fokus lesi. Ukur tahap indikator sebagai tindak balas terhadap suntikan ubat untuk subkutaneus atau intradermal (biasanya sebelum dan 48 dan 72 jam selepas itu). Selepas itu, tahap penambahan tahap penanda (dalam%) dikira berkenaan dengan peringkat permulaan.

Penentuan optimum dalam air kencing aktiviti enzim tertentu organ transamnidase, rupanya yang dinyatakan dalam kekalahan ginjal dari pelbagai sifat. Kajian transamidinase hanya dibenarkan di bawah keadaan suntikan subkutaneus tuberculin untuk memburukkan lagi proses keradangan tempatan. Tentukan aktiviti transamidine dalam air kencing pada mulanya dan 24-72 jam selepas pengenalan 50 tuberkulin TE. Pembesaran fermentia dalam 2 kali dan lebih membolehkan 82% kes membezakan tuberkulosis aktif buah pinggang akibat pembengkakan pyelonephritis kronik.

Dengan tuberkulosis organ kelamin wanita, kepekatan haptoglobin dan dialdehid malonik dalam darah ditentukan dalam keadaan ujian tuberkulin yang provokatif. Tabiat tuberkulin yang subkutane dengan dos 50 TE dan 72 jam kemudian melakukan kajian biokimia kedua. Dalam kes etiologi tuberkulosis, tahap peningkatan dalam haptoglobin tidak kurang daripada 28%, dan tahap malondialdehid adalah 39% atau lebih. Penentuan aktiviti adenosin deaminase dalam cecair peritoneal yang diperoleh dari ruang Douglas juga digunakan. Tebal ini diperiksa semula 72 jam selepas suntikan intradermal tuberkulin pada dos 0.1 TE dan 0.01 TE ke dalam unjuran organ genital dalaman pada dinding abdomen anterior. Memihak kepada proses tuberkulosis, peningkatan aktiviti adenosin deaminase adalah 10% atau lebih berbanding dengan yang awal.

Apabila mata terjejas, reaksi tumpuan yang berlaku di mata sebagai tindak balas terhadap rangsangan antigen diperiksa. Adalah tidak diingini untuk menghasilkan tindak balas yang jelas, disertai dengan penurunan fungsi visual. Oleh kerana penilaian tindak balas fokal yang minima seringkali sukar, untuk tujuan kesimpulan, disyorkan untuk mengorientasikan selari dan pada tahap pertumbuhan dalam serum darah haptoglobin atau adenosin deaminase.

Semua kajian biokimia perlu dilakukan bersamaan dengan kaedah lain.

[20], [21], [22], [23],

Penyelidikan sistem pembekuan darah

Perkaitan status penyelidikan sistem pembekuan darah TB adalah disebabkan oleh kehadiran beberapa pesakit dengan haemoptysis pulmonari tuberkulosis atau pendarahan paru-paru, serta komplikasi hemocoagulation dalam rawatan pembedahan batuk kering. Di samping itu, aliran laten hemocoagulation intravaskular yang secara semula jadi mengiringi tuberkulosis memberi kesan kepada perjalanan penyakit dan keberkesanan kemoterapi.

Pada pesakit dengan kelaziman TB paru-paru komponen keradangan exudative penurunan yang diperhatikan dalam aktiviti pencegahan penggumpalan darah darah. Pada pesakit dengan kelaziman yang rendah luka tertentu dalam paru-paru dengan penguasaan daripada hemocoagulation produktif komponen radang intravaskular melahirkan sedikit. Pada pesakit dengan batuk kering dengan hemoptysis dan paru-paru sistem pembekuan darah pendarahan negeri adalah berbeza: pada pesakit dengan kehilangan darah rendah pada gemoptoe ketinggian atau selepas penamatan terdapat peningkatan yang ketara dalam keupayaan pembekuan darah disebabkan oleh kesungguhan teruk trombinoobrazovaniya samping mengekalkan peningkatan "struktur" pembekuan. Pada pesakit dengan kehilangan darah yang besar, penurunan dalam potensi pembekuan diperhatikan kerana penurunan kepekatan fibrinogen. Aktiviti faktor XIII, kiraan platelet. Pada peringkat rawatan pembedahan, pesakit dengan bentuk tuberkulosis yang terhad tidak mengalami gangguan yang penting dengan sistem homeostasis. Pesakit dengan proses meluas dalam melaksanakan pnevmon- atau plevropnevmonektomii kerap membangunkan DIC, yang boleh mengambil bentuk "penyakit kedua."

Untuk memantau keadaan pembekuan darah pada pesakit dengan batuk kering perlu dijalankan penentuan masa tromboplastin separa yang diaktifkan (aPTT), fibrinogen, masa thrombin, indeks prothrombin dan masa pendarahan dan masa pembekuan.

[24], [25], [26], [27], [28]

Penyelidikan hormon

Baru-baru ini pemerhatian eksperimen dan klinikal menunjukkan kehadiran perubahan status hormon dalam pneumonia bersakit tertentu. Ia membuktikan bahawa pembetulan disfungsi, sistem pituitari-tiroid pituitari-adrenal dan fungsi pankreas sempena terapi anti-TB menyumbang kepada pengaktifan fibrogenesis dan pembaikan pada keradangan tertentu locus.

Keadaan fungsi sistem pituitari-tiroid dihakimi oleh kandungan dalam serum darah triiodothyronine (T ₃ ), tiroksin (T ₄ ), pituitari tiroid merangsang hormon (TSH). Telah dijelaskan bahawa hypothyroidism subklinikal dikesan dalam 38-45% pesakit dengan tuberkulosis pulmonari, dan selalunya ia didiagnosis dengan bentuk penyebaran dan berserabut yang berserabut. Di bawah bentuk-bentuk sama kebanyakan peringkat dikurangkan secara mendadak kedua-dua T ₃ dan T ₄, dan datang ketidakseimbangan hormon ini dalam bentuk meningkatkan nisbah T ₄ / T _s.

Fungsi adrenocortical dinilai oleh tahap kortisol di dalam serum darah, dan fungsi endokrin pankreas - kepekatan insulin imunisasi reaktif. Dalam fasa akut penyakit berjangkit, keperluan kortisol endogen dan insulin meningkat. Hyperinsulinemia juga memberi kesaksian kepada ketahanan insulin pada tisu badan, yang lazim bagi apa-apa proses keradangan yang aktif, khususnya, khusus. Penentuan fungsi glukokortikoid kelenjar adrenal dengan tuberkulosis pulmonari yang aktif membolehkan untuk mendedahkan kehadiran hypercorticism dalam kebanyakan pesakit. Tahap normal kepekatan darah kortisol dalam pesakit dengan keradangan berjangkit dalam tempoh yang akut boleh dianggap sebagai kegagalan relatif fungsi glukokortikoid korteks adrenal yang boleh dijadikan sebagai asas untuk memegang dos terapi penggantian mencukupi glucocorticoids.

Hampir satu pertiga daripada pesakit dengan tuberkulosis pulmonari dapat menegaskan bahawa tahap insulinemia di dalamnya agak rendah dan mendekati batas bawah norma, sedangkan 13-20% mengamati hyperinsulinisme yang signifikan. Kedua-dua hipo- dan hyperinsulinisme relatif adalah faktor risiko tinggi bagi perkembangan pelanggaran metabolisme karbohidrat dalam pelbagai peringkat. Perubahan dalam fungsi fungsional B sel pankreas memerlukan pengawasan secara tetap terhadap glikemia pada pesakit dengan tuberkulosis dan pencegahan diabetes mellitus yang tepat pada masanya. Selain itu. Ini berfungsi sebagai pembenaran tambahan untuk kesesuaian menggunakan dos fisiologi insulin dalam terapi kompleks tuberkulosis.

Secara umum, tahap yang lebih rendah hormon tiroid dan hypercortisolemia mereka ketidakseimbangan dan hyperinsulinism jangkauan terbesar dalam pesakit dengan kursus teruk proses bersakit paru-paru, dengan kerosakan paru-paru yang luas dan gejala yang teruk batuk kering mabuk.

Diagnosis mikrobiologi tuberkulosis

Kajian mikrobiologi diperlukan untuk mengenal pasti pesakit dengan batuk kering, mengesahkan diagnosis, pemantauan dan pembetulan kemoterapi, menilai hasil rawatan, dengan kata lain, dari saat pesakit berdaftar dengan tuberkulosis sebelum mengambilnya.

Semua program dan projek epidemiologi adalah berdasarkan kepada penilaian jumlah ekskret bakteria, yang tidak boleh dilakukan tanpa menggunakan kaedah makmal untuk mengesan tuberculosis mycobacteria. Dalam kaji selidik penduduk yang tidak teratur yang dipanggil, peratusan penyerang bakteria mencapai 70 atau lebih, yang menjadikan kaedah makmal sebagai cara yang cukup berkesan untuk mengenal pasti pesakit tuberkulosis di kalangan kumpulan penduduk ini.

Kaedah mikrobiologi tradisional untuk mendiagnosis tuberkulosis adalah kajian bacterioscopic dan budaya. Kaedah moden menganggap penanaman mycobacterium tuberculosis dalam sistem automatik, penetapan PCR. Walau bagaimanapun, semua kaedah ini semestinya bergabung dengan kaedah bakteriologi klasik.

Pengumpulan bahan diagnostik

Keberkesanan kajian makmal bergantung kepada kualiti bahan diagnostik. Mematuhi peraturan untuk pengumpulan, penyimpanan dan pengangkutan bahan diagnostik dan pelaksanaan tepat algoritma penilaian pesakit langsung mempengaruhi hasil dan memastikan keselamatan biologi.

Untuk ujian terhadap tuberkulosis, pelbagai bahan digunakan. Kerana kenyataan bahawa bentuk paling biasa luka bersakit paru-paru TB logkih-, bahan asas untuk penyelidikan mempertimbangkan kahak dan lain-lain jenis tracheobronchial cerai: atas rembesan saluran pernafasan diperolehi selepas aerosol penyedutan: basuhan bronkial; bilas bronchoalveolar; bahan yang diperoleh oleh bronkoskopi dan transtracheal intrapulmonary biopsi dari aspirat bronkial, swab berhubung dgn pangkal tekak, rembesan dari luka dan calitan al.

Keberkesanan penyelidikan bertambah jika koleksi bahan terkawal dari pesakit dijalankan. Untuk tujuan ini, bilik yang disediakan khas disediakan atau teksi khas dibeli. Pengumpulan bahan adalah prosedur yang berbahaya, oleh itu adalah perlu untuk mengumpul bahan untuk penyelidikan, memerhatikan peraturan keselamatan berjangkit.

Bahan untuk ujian pada mycobacterium tuberculosis dikumpulkan dalam botol steril dengan topi ketat diskrit untuk mengelakkan pencemaran alam sekitar dan melindungi bahan yang dikumpulkan dari pencemaran.

Vial untuk pengumpulan bahan diagnostik mesti memenuhi keperluan berikut:

• mesti dibuat daripada bahan tahan impak;
• dengan mudah dicairkan semasa autoklaf;
• menjadi jumlah yang mencukupi (40-50 ml):
• mempunyai pembukaan yang luas untuk pengumpulan dahak (diameter tidak kurang daripada 30 mm);
• mudah untuk mengendalikan, telus atau lut, supaya anda boleh menilai kuantiti dan kualiti sampel yang dikumpul tanpa membuka tudung.

Untuk mendapatkan hasil penyelidikan yang optimum, syarat berikut mesti dipatuhi:

• Kumpulkan bahan sebelum kemoterapi bermula;
• bahan untuk kajian itu mesti dikumpulkan sebelum pengambilan makanan dan ubat pagi;
• untuk penyelidikan ia adalah wajar untuk mengumpul sekurang-kurangnya 3 sampel kahak pagi. Kumpulkan dahak selama 3 hari berturut-turut;
• bahan yang dikumpul mesti dihantar ke makmal secepat mungkin:
• dalam kes di mana ia adalah mustahil sekali untuk menyampaikan bahan ke makmal, ia disimpan dalam peti sejuk pada suhu udara 4 ° C tidak melebihi 48 jam;
• Apabila mengangkut bahan, perlu mengawasi integriti botol.

Sputum yang terkumpul dengan betul adalah mukosa atau mukosa. Jumlah optimum daripada sputum yang diuji ialah 3-5 ml.

Sputum dikumpulkan di bawah penyeliaan seorang profesional perubatan. Orang yang bertanggungjawab untuk pengambilan sputum harus mengikuti pelaksanaan peraturan tertentu:

• perlu menjelaskan kepada pesakit tujuan kajian dan keperluan untuk batuk tidak air liur atau nasofaring nasofaring, tetapi kandungan saluran pernapasan dalam. Ini dapat dicapai akibat batuk yang produktif yang berlaku selepas beberapa (2) nafas dalam. Ia juga perlu untuk memberi amaran kepada pesakit bahawa ia harus membilas mulutnya dengan air rebus, untuk menghapuskan bahagian utama mikroflora yang tumbuh di rongga mulut dan sisa makanan yang menghalang pemeriksaan denggi;
• seorang pekerja perubatan yang mengambil bahagian dalam pengumpulan dadah, sebagai tambahan kepada jubah mandi dan topi, mesti memakai topeng, sarung tangan getah dan apron getah;
• berdiri di belakang pesakit, dia disyorkan untuk menyimpan botol sedekat mungkin ke bibirnya dan segera memisahkannya dengan kahak ketika batuknya, dan harus diberikan aliran udara diarahkan dari pekerja kesehatan:
• Setelah selesai pengumpulan kupon, pekerja kesihatan harus menutup botol dengan tutup dengan teliti dan menilai kuantiti dan kualiti sputum yang dikumpulkan. Kemudian botol dilabel dan diletakkan di dalam bix khas untuk pengangkutan ke makmal.

Jika pesakit tidak menghasilkan kahak, malam sebelum dan pada awal pagi pada hari pengumpulan bahan-bahan yang diperlukan untuk memberinya ekspektoran :. An ekstrak akar Marshmallow (mukaltin), bromhexine, ambroxol, dan lain-lain - atau memohon penyedutan menjengkelkan menggunakan peralatan yang dipasang di dalam bilik untuk mengumpul kahak. Bahan yang dikumpulkan dengan cara ini tidak tertakluk kepada pemuliharaan dan harus diperiksa pada hari pengumpulan. Untuk mengelakkan "pemusnahan" dalam makmal ke arah harus membuat tanda khas.

Sekiranya kajian mikrobiologi tidak dijalankan di kemudahan ini, bahan diagnostik yang dikumpul hendaklah dihantar ke makmal, dengan syarat bahan tersebut dipelihara dalam selang antara penghantaran dalam peti sejuk atau dengan penggunaan bahan pengawet. Menyerahkan bahan ke makmal di dalam peti pengangkutan, yang dapat dengan mudah didisinfeksi. Setiap sampel hendaklah disediakan dengan label yang bersesuaian, dan keseluruhannya hendaklah diisi dengan borang yang disertakan.

[29], [30], [31],

Mod dan kekerapan pemeriksaan pesakit

Pada awal, diagnostik yang dikenali sebagai pemeriksaan pesakit untuk tuberkulosis, adalah perlu untuk memeriksa sekurang-kurangnya 3 bahagian dahak selama 2 atau 3 hari. Dikumpulkan di bawah pengawasan kakitangan perubatan, yang meningkatkan keberkesanan mikroskopi.

Pemeriksaan utama untuk tuberkulosis perlu dilakukan oleh semua institusi diagnostik perubatan sistem penjagaan kesihatan. Baru-baru ini, pusat mikroskop yang dipanggil, dilengkapi dengan mikroskop moden dan peralatan untuk keselamatan wabak, telah dianjurkan berdasarkan makmal diagnostik klinikal untuk meningkatkan kecekapan peperiksaan awal.

Di dalam kemudahan anti-TB, ujian pemeriksaan digunakan termasuk pemeriksaan dahak atau bahan diagnostik lain sekurang-kurangnya 3 kali ganda selama 3 hari. Semasa rawatan, kajian mikrobiologi dilakukan secara berkala sekurang-kurangnya sekali sebulan semasa fasa kemoterapi intensif. Pada peralihan kepada fasa rawatan, kajian dijalankan kurang kerap - dengan selang 2-3 bulan, sementara kekerapan kajian dikurangkan menjadi dua.

Ciri pengumpulan bahan diagnostik untuk batuk kering ekstrapulmonari

Keanehan dari bahan patologis dalam bentuk tuberkulosis extrapulmonary adalah kepekatan rendah mycobacterium tuberculosis di dalamnya, yang memerlukan kaedah pemeriksaan mikrobiologi yang lebih sensitif, pertama sekali, kaedah penyebaran pada medium nutrien.

Dengan tuberkulosis sistem genitourinary, air kencing adalah bahan kajian yang paling mudah diakses. Pengumpulan air kencing perlu dilakukan oleh jururawat yang terlatih.

Alat kelamin luaran dibasuh dengan air dengan sabun atau larutan potassium permanganate yang lemah. Pembukaan luar uretra dengan teliti dirawat. Dalam botol steril, bahagian purata air kencing pagi dikumpulkan: pada lelaki, secara semulajadi, pada wanita, menggunakan kateter. Urin dari pelvis buah pinggang dikumpulkan dalam tiub steril dengan catheterization satu atau dua buah pinggang, dalam kes kedua - semestinya secara berasingan dari setiap buah pinggang. Sebilangan kecil air kencing ini disentri, sedimen diperiksa.

Pada lelaki, sperma, test punctate, rahsia prostat tertumpu kepada sentrifugasi untuk mendapatkan mendakan. Dengan sebarang penyetempatan proses tertentu di kawasan kelamin pada lelaki, urutan prostat dapat mempromosikan rembesan sekresi yang mengandung mycobacterium tuberculosis.

Darah haid pada wanita dikumpulkan dengan menghisap atau menggunakan topi Kafka. Bahan yang diperoleh dibebaskan dari sel darah merah, mencuci dengan air suling diikuti dengan sentrifugasi. Endapan diperiksa.

Peruntukan dari kanal serviks uterus dikumpulkan dalam beberapa kapasiti Kafka atau cap, iaitu, adalah wajar untuk mengumpul 1-2 ml bahan patologi.

Bahan yang diperoleh daripada campur tangan pembedahan pada buah pinggang, alat kelamin. Dengan biopsi, pengikatan dari endometrium, homogenisasi. Untuk melakukan ini, ia diletakkan di dalam mortar steril dan dihancurkan dengan gunting steril. Dengan buburan ini telah ditambah pasir sungai steril dalam jumlah yang sama dengan berat badan, dan kemudian ditambah dengan 0,5-1.0 ml isotonik larutan natrium klorida, dan segala-galanya telah triturated sehingga massa seperti bubur dengan penambahan larutan natrium klorida isotonik (4-5 ml). Kemudian jisim dibenarkan untuk menyelesaikan 1-1.5 minit, supernatan itu diperiksa.

Tuberkulosis tulang dan sendi. Buatan (nanah abses) yang diperoleh dengan picagari steril ditempatkan dalam hidangan steril dan segera diserahkan ke makmal. Muka sterile, sebelum dibasahkan dengan larutan natrium klorida isotonik steril, ambil 2-5 ml nanah, pindahkannya ke botol manik dan tambah lagi 2-3 ml larutan natrium klorida isotonik. Botol ditutup dengan gabus dan digoncang dalam alat joker selama 8-10 minit. Suspensi homogenis diperiksa.

Dalam bentuk tuberkulosis osteoartikular yang fistulous, nanah dari fistula diambil. Pelepasan berlebihan dikumpulkan terus ke dalam tiub ujian. Dalam kes-kes tanpa lemak penyakit pd gusi fistula dibasuh dengan larutan natrium klorida isotonik steril, dan basuhan dikumpulkan ke dalam tiub ujian, atau sekeping tampon berubat dengan nanah dihantar untuk analisis.

Bahan pembedahan yang diperoleh semasa campur tangan pembedahan pada tulang dan sendi dapat terdiri dari massa beracun-nekrotik, granulasi, tisu parut, tisu tulang, tisu membran sinovial dan substrat lain. Rawatannya dilakukan, seperti dalam tuberkulosis buah pinggang.

Kajian mikrobiologi cecair sinovial dalam penyelesaian larutan natrium sitrat 3% (nisbah 1: 1) untuk mencegah pembekuan dilakukan segera selepas tusuk.

Tuberkulosis nodus limfa. Nenek, yang diekstrak semasa tusukan nodus limfa, juga diperiksa. Sebagai nanah abses. Tisu nodus limfa yang diperoleh semasa campur tangan pembedahan, biopsi, diperiksa, seperti bentuk tuberkulosis lain.

Kajian massal tinja pada mycobacterium tuberculosis sangat jarang berlaku, kerana kekurangan jumlah hasil positif.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mikroskopi Mycobacterium

Mikroskopi sputum adalah kaedah yang agak cepat, mudah dan murah yang harus digunakan dalam semua kes dengan disyaki batuk kering. Di samping itu, kajian ini dijalankan untuk menilai keberkesanan kemoterapi dan memastikan pemulihan atau kegagalan rawatan jika tiada ujian kebudayaan.

Dua kaedah pemeriksaan mikroskopik digunakan:

• kaedah mikroskop langsung, apabila suatu smear disediakan secara langsung dari bahan diagnostik;
• kaedah mikroskopi sedimen yang disediakan daripada bahan yang dirawat sebagai bahan dekontaminasi untuk kebudayaan.

Kaedah pertama digunakan di makmal tersebut di mana hanya kajian mikroskopik dijalankan (makmal klinikal dan diagnostik rangkaian perubatan umum).

Hasil pemeriksaan mikroskopik terbaik diperoleh dengan menumpukan perhatian pada bahan diagnostik (contohnya, melalui sentrifugasi).

Untuk mengesan mycobacterium tuberculosis dengan kebarangkalian 50% ketika menjalankan mikroskopi, 1 ml sel darah putih harus mengandungi lebih daripada 5000 sel mikroba. Darah pesakit dengan bentuk paru-paru tuberkulosis biasanya mengandungi sejumlah besar bakteria asid cepat, yang membolehkan mereka dapat dikesan dengan pasti oleh bacterioscopy. Sensitiviti diagnostik kaedah ini dapat diperbaiki dengan memeriksa beberapa sampel dahak dari satu pesakit. Hasil negatif dari pemeriksaan bacterioscopic tidak mengecualikan diagnosis tuberkulosis, kerana dedah beberapa pesakit mengandungi kurang mikobakteria daripada dapat dikesan dengan mikroskopi. Penyediaan yang lemah dalam pesakit barah juga boleh menyebabkan keputusan negatif dari pemeriksaan bacterioscopic.

Kaedah yang paling biasa untuk pengesanan mikobakteria asid-cepat dalam smear adalah warna mengikut Tsiol-Nelsen. Kaedah ini didasarkan pada penembusan fuchsin karbohidrat ke sel mikroba melalui membran yang merangkumi lapisan waxy-lipid, manakala secara bersamaan pemanasan dan tindakan etsa kuat fenol. Perubahan warna pada smear dengan larutan 25% asid sulfurik atau 3% asid hidroklorik menyebabkan perubahan warna semua struktur tanpa asid cepat. Unsur-unsur yang berwarna berubah-ubah adalah berwarna dengan larutan 0.3% biru metilena. Mycobacteria tidak melihat pewarna aniline yang biasa, akibatnya mycobacteria yang cepat asid berwarna merah merah, dan mikrob lain dan unsur selular - berwarna biru.

Untuk mempelajari smear yang berwarna oleh Tsilyu-Nelsen, gunakan mikroskop binokular ringan dengan objektif rendaman (pembesaran 90 atau 100 kali ganda) dan lensa kanta dengan pembesaran 7- atau 10 kali ganda. Terokai 100 bidang penglihatan, yang cukup untuk mengenal pasti mikobakteria tunggal di dalam smear. Sekiranya hasil kajian sedemikian negatif, untuk pengesahan, disarankan untuk melihat 200 bidang penglihatan. Catat hasilnya, menunjukkan bilangan bacaan asid cepat (KUM) yang dikesan.

Sebagai tambahan kepada teknik ini, fluorochromes warna digunakan untuk mikroskopi luminescent, yang membolehkan mencapai hasil terbaik. Penggunaan kaedah ini meningkatkan kecekapan mikroskopi sebanyak 10-15%. Apabila merawat mikobakteria dengan pewarna luminescent (auramine, rhodamine, dan sebagainya), bahan ini juga mengikat struktur lilin seperti sel mikroba. Apabila menyinari sel berwarna dengan sumber cahaya yang menarik (spektrum radiasi ultraviolet tertentu), mereka mula bercahaya dengan oren atau cahaya merah terang pada latar belakang hijau hitam atau gelap. Oleh kerana kecerahan tinggi dan kontras imej yang kelihatan, pembesaran keseluruhan mikroskop dapat dikurangkan 4-10 kali, luas pandangan melebar dan masa tontonan penyediaan berkurangan. Seiring dengan ini, kerana bidang yang lebih besar, anda dapat meningkatkan keselesaan kajian.

Apabila mikroskop pendarfluor digunakan untuk melihat kawasan yang sama, smear itu membelanjakan masa yang kurang ketara berbanding dengan mikroskop cahaya dari pewarnaan Tsiol-Nelsen. Jika untuk hari kerja mikroskop mengkaji kira-kira 20-25 jenis smear tersebut, maka dengan bantuan mikroskop pendarfluor, dia boleh memeriksa lebih daripada 60-80 sampel pada masa yang sama. Mikroskopis yang berpengalaman tahu bahawa pewarnaan sel dengan campuran auramin dan rhodamin adalah dalam beberapa cara khusus untuk bacilli asid cepat, yang dalam kes ini kelihatan seperti tongkat emas. Saprophytes dicat dengan warna kehijauan.

Satu lagi kelebihan penting kaedah mikroskop pendarfluor - keupayaan untuk mengesan Mycobacterium diubah, hilang di bawah pengaruh faktor-faktor yang buruk, termasuk kemoterapi intensif, harta kislotousotoychivosti dan tidak dikesan berkaitan dengan pewarnaan ini Ziehl-Nelsenu.

Kelemahan kaedah mikroskop pendarfluor termasuk kos mikroskop yang agak tinggi dan operasinya. Walau bagaimanapun, di makmal besar berpusat atau lain-lain, di mana beban melebihi norma 3 juruteknik makmal yang bekerja dengan tiga mikroskop konvensional, lebih murah menggunakan satu mikroskop pendarfluor sebaliknya.

Kaedah bakterioskopik mempunyai kekhususan yang agak tinggi (89-100%). Kira-kira 97% daripada keputusan positif yang diperolehi oleh kaedah mikroskopi dengan jelas disahkan oleh hasil penaburan.

Perlu diperhatikan bahawa apabila pemeriksaan mikroskopik dari bahan parut patologi, adalah mustahil untuk menentukan spesies kepunyaan mycobacteria yang cepat asid. Kaedah mikroskopi membolehkan untuk memberi pendapat hanya kepada kehadiran atau ketiadaan asid dalam penyediaan mikroorganisma, yang dapat dijelaskan oleh kewujudan dalam alam semula jadi sebilangan besar morfologi yang serupa dengan bersakit mycobacteria kompleks asid nontubercular mikroorganisma tahan.

Keputusan mikroskopi dinilai dalam unit separuhitatif.

Untuk dapat membandingkan hasil kaedah mikroskopi yang berbeza, pekali empirikal diperkenalkan. Sebagai contoh, untuk membandingkan keputusan calitan berwarna dengan pewarna pendarfluor, mikroskop cahaya penyelidikan data (1000 kali pembesaran), ia adalah perlu untuk membahagikan jumlah riba asid-cepat dikesan oleh mikroskop pendarfluor, pekali sama pada pembesaran 250 kali ganda - hingga 10, 450 kali ganda - hingga 4, dengan 630 kali ganda - hingga 2.

Ciri-ciri mikroskopi untuk batuk kering ekstrapulmonari

Mikroskopi langsung dilakukan, serta mikroskopi sabun siap selepas pengayaan, diikuti oleh pewarna Tsiol-Nelsen atau pewarna luminescent. Mikroskopi langsung smear tidak berkesan kerana kepekatan mycobacteria yang rendah dalam bahan, dan oleh itu lebih rasional menggunakan kaedah pengayaan. Yang paling berkesan ialah sentrifugasi. Sekiranya bahan biologi adalah likat, sentrifugasi digunakan dengan homogenisasi serapan dan pencairan bahan, yang dijalankan menggunakan sentrifugal berkepala tinggi dengan daya sentrifugasi 3000 g dan penyelesaian hipoklorit. Kaedah pengayaan lain, seperti pengapungan mikro, tidak digunakan sekarang kerana pembentukan aerosol berbahaya secara biologi.

[37], [38],

Kaedah budaya diagnosis tuberkulosis

Kaedah menyemai, atau kaedah budaya, lebih sensitif daripada mikroskopi smear, dan mempunyai beberapa kelebihan berbanding yang lain. Ia membolehkan untuk mengesan beberapa puluhan mycobacteria yang berdaya maju dalam bahan ujian dan mempunyai nilai diagnostik yang hebat. Ini amat penting ketika memeriksa bahan dari pesakit yang baru didiagnosis atau dirawat yang melepaskan sedikit mikobakteria.

Berbanding dengan mikroskopi, penyelidikan kultur membolehkan peningkatan jumlah pesakit TB yang didiagnosis lebih daripada 15-25%, dan juga mengesahkan batuk kering pada peringkat terdahulu, ketika penyakit itu masih dapat diterima. Keuntungan yang sangat penting dalam ujian kultur adalah kemungkinan mendapatkan budaya penggali yang dapat dikenalpasti dan dikaji berkenaan sensitiviti dadah, virulensi dan sifat biologi yang lain.

Kelemahan kaedah penanaman termasuk tempoh mereka (masa menunggu bahan mencapai 10 minggu). Kos yang lebih tinggi, kerumitan pemprosesan bahan diagnostik.

Prinsip prasyarat rawatan bahan diagnostik

Kaedah mikrobiologi konvensional tidak boleh digunakan dalam menjalankan kajian mengenai batuk kering. Ini disebabkan hakikatnya. Bahawa mycobacterium tuberculosis tumbuh sangat perlahan, dan kebanyakan sampel klinikal mengandungi mikroorganisma pyogenic dan putrefactive yang berkembang pesat, kulat. Pertumbuhan pesat mereka terhadap media nutrien yang kaya mengganggu perkembangan mikobakteri dan tidak membenarkan mengasingkan agen penyebab tuberkulosis, jadi bahan diagnostik mesti dipersiapkan sebelum pembenihan. Selain itu, mikobakteria yang dilepaskan dari saluran udara pesakit biasanya dikelilingi oleh sejumlah besar lendir, menjadikannya sukar untuk menumpukan perhatian. Dalam hal ini, sebelum menanam dahak dan bahan-bahan lain yang serupa, pencairan mereka, dekontaminasi diperlukan.

Semua detergen dan dekontamin mempunyai kesan toksik yang lebih ketara terhadap mikobakteria. Akibat pemprosesan, sehingga 90% mikobakteria boleh mati. Untuk memastikan cukup penduduk mycobacterial, membiarkan keperluan untuk menggunakan teknik pemprosesan yang membolehkan, dalam satu tangan, untuk menyekat bakteria pyogenic berkembang pesat dan busuk, dan di pihak yang lain - untuk mengekalkan daya maju mycobacteria di dalam bahan.

Bergantung kepada bahan, darjah kehomogenan dan pencemaran untuk pra-pemprosesan menggunakan pelbagai Penyahlumus: Kahak - 4% larutan natrium hidroksida, penyelesaian trohzameschonnogo natrium fosfat 10%, benzalkonium klorida, fosfat trisodium, NALC-NaOH (N-acetyl-L-cysteine natrium hidroksida) pada kepekatan akhir sebanyak 1% NaOH, dalam air kencing dan bahan-bahan cecair lain - larutan asid sulfurik 3%, sampel yang tercemar, bahan-bahan yang mengandungi lemak - penyelesaian asid oksalik kepada 5%. Di samping itu, dalam beberapa kes, enzim, surfaktan (deterjen) digunakan. Penggunaan Tween dan beberapa detergen lain disertai oleh kematian sel mikobakteri yang lebih kecil (40-50% hidup). Walau bagaimanapun, ia hanya boleh digunakan untuk bahan cecair. Pengedaran terbesar di dunia ialah NALC-NaOH. Dihasilkan dalam set. Kaedah ini membolehkan untuk memperuntukkan lebih daripada 85% daripada populasi sel mikobakteria. Dekontaminasi bahan pepejal yang mengandung kain lebih sukar, kerana sukar untuk menebak derajat penyebaran bahan selama proses homogenisasi. Sebagai contoh, rawatan biopsi kelenjar getah bening sering disertai oleh peningkatan kekerapan pencemaran oleh flora luaran. Dalam kes ini, 1% etonium boleh digunakan.

Bahan bukan homogen diseragamkan dengan manik kaca dengan kehadiran dekontaminasi. Bahan-bahan cecair adalah pra-sentrifuged dan hanya precipitate dirawat.

Teknik penanaman dan pengeraman

Selepas pretreatment, bahan itu disentri, dengan itu merangsang mikobakteria dan meningkatkan kandungannya dalam sedimen ("pengayaan enapge"). Dendam yang terhasil akan dinetralkan dan disuntik (diinokulasi) dengan media nutrien yang padat atau dengan media cecair (semiliquid). Dari seluruh sedimen, smear disediakan untuk peperiksaan mikroskopik. Teknik pembenihan harus menghalang pencemaran silang dari bahan diagnostik.

Untuk tafsiran klinikal yang boleh dipercayai tentang hasil kajian mikrobiologi, peraturan berikut mesti diperhatikan: kajian mikroskopik dan budaya mesti dilakukan selari dari sampel yang sama dari bahan diagnostik.

Tiub yang disuntik diletakkan dalam termostat pada 37 ^° C selama 2 hari dalam kedudukan mendatar. Ini memastikan lebih banyak penyerapan bahan ke medium budaya. Selepas 2 hari, tiub dipindahkan ke kedudukan menegak dan tertutup rapat dengan getah atau palam silikon untuk mengelakkan pengeringan media yang disemai.

Tanaman yang dieram pada 37 ^mengenai C selama 10-12 minggu dengan tontonan mingguan biasa. Untuk setiap pratonton, parameter berikut direkodkan:

• tempoh yang diperhatikan secara visual dari hari pertumbuhan menyemai;
• kadar pertumbuhan (bilangan CFU);
• pencemaran tanaman oleh flora mikroorganisma luar atau kulat (tiub sedemikian dikeluarkan);
• kekurangan pertumbuhan yang ketara. Tiub dibiarkan dalam termostat sehingga tontonan seterusnya.

Media nutrien

Pelbagai media nutrien digunakan untuk penanaman mikobakteria; padat, separa cecair, cecair. Walau bagaimanapun, tiada media nutrien yang diketahui mempunyai sifat yang menjamin pertumbuhan semua sel mikrobakteri. Sehubungan dengan ini, media nutrien 2-3 komposisi yang berbeza disyorkan untuk digunakan serentak untuk meningkatkan keberkesanannya.

WHO mengesyorkan persekitaran Levenstein-Jensen sebagai medium standard untuk pengasingan utama agen penyebab tuberkulosis dan untuk menentukan kepekaan dadahnya. Ini adalah persekitaran telur yang padat di mana pertumbuhan mikobakteria diperoleh pada hari ke-20 ke-25 setelah pembenihan bahan bakterioskopik positif. Tanaman bahan negatif bacterioscopically memerlukan tempoh inkubasi yang lebih lama (sehingga 10-12 minggu).

Di negara kita, cadangan E.R. Finn telinga persekitaran Finn-II. Ia berbeza, bukan L-asparagine, ia menggunakan natrium glutamat, yang mencetuskan cara lain mensintesis asam amino mikobakteria. Pertumbuhan muncul pada medium ini lebih awal, dan kekerapan peruntukan mycobacteria adalah 6-8% lebih tinggi daripada medium Lowenstein-Jensen.

Untuk meningkatkan keberkesanan diagnosis bakteria tuberkulosis ekstrapulmonary, disarankan untuk memasukkan media Finn-II yang telah diubahsuai dalam kompleks media nutrien. Untuk mempercepat pertumbuhan, natrium thioglycolate 0.05%, yang mengurangkan kepekatan oksigen, ditambah tambahan kepada medium nutrien Finn-II. Untuk melindungi enzim daripada sistem Mycobacterium produk toksik pengoksidaan lipid dalam medium Finn-II ditadbir antioksidan α-tokoferol asetat nutrien dalam kepekatan 0.001 / ml mcg. Pembenihan bahan diagnostik dilakukan mengikut prosedur piawai.

Di makmal anti-tuberkulosis Rusia, pengubahsuaian media nutrien yang padat digunakan; cadangan G.G. Medium nutrien Mordovian "Baru", yang dibangunkan oleh V.A. Media nutrien anicik A-6 dan A-9, dsb.

Disebabkan oleh hakikat bahawa dalam proses kemoterapi adalah kerosakan kepada pelbagai sistem metabolik sel mikrob, beberapa penduduk mycobacterial kehilangan keupayaan untuk berkembang secara normal di media nutrien konvensional dan memerlukan osmotically seimbang (atau separa cecair) budaya media.

Menilai dan merakam keputusan pembenihan bahan diagnostik

Sesetengah jenis dan spesies mikobakteria berkembang dengan perlahan, pertumbuhan boleh muncul walaupun pada hari ke-90. Bilangan tanaman sedemikian adalah kecil, tetapi ini memungkinkan untuk menahan tanaman dalam termostat selama 2.5-3 bulan.

Kultur kekotoran mycobacterium tuberculosis biasanya tumbuh pada persekitaran telur padat dalam bentuk koloni R-bentuk pelbagai saiz dan spesies. Koloni kering, berkedut, gading, sedikit berpigmen. Dalam media lain, koloni mycobacterium tuberculosis mungkin lebih lembap. Selepas menjalani kemoterapi atau semasa rawatan, koloni halus dengan pertumbuhan lembap (bentuk S) boleh diperuntukkan.

Apabila mengasingkan tanaman, satu set kajian khas digunakan untuk membezakan mycobacterium tuberculosis daripada mycobacteria bukan tuberculosis dan saprophytes yang tahan asid.

Satu tindak balas yang positif diberikan selepas pemeriksaan mikroskopik mandatori tisu Tsiol-Nelsen berwarna dari koloni yang ditanam. Dalam kes pertumbuhan mycobacteria dalam smears, kayu merah cerah ditemui yang terletak secara tunggal atau dalam kelompok membentuk kluster dalam bentuk dirasakan atau braids. Dalam budaya muda, terutama diasingkan daripada rawatan jangka panjang pesakit dengan kemoterapi, mycobacteria berbeza polymorphism yang dinyatakan, sehingga kehadiran berbentuk batang, bersama-sama dengan pendek, versi yang hampir coccoid atau panjang yang menyerupai miselium.

Kadar pertumbuhan mikobakteri ditunjukkan oleh skim berikut: (+) - 1-20 cfu in vitro (pengimbunan bakteria yang kurang); (++) - 20-100 CFU in vitro (penyingkiran bakteria sederhana); (+++) -> 100 CFU in vitro (perkumuhan bakteria yang banyak). Dalam diagnosis makmal tuberkulosis, tidak cukup untuk menjawab sama ada mycobacterium dikesan oleh satu atau kaedah lain. Mempunyai pemahaman terperinci mengenai tahap dan sifat populasi mikobakteria, komposisi dan sifatnya. Ia adalah data yang membolehkan kita mentafsir keadaan proses itu, merancang taktik dan membetulkan rawatan tepat pada masanya.

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, untuk mempercepat pertumbuhan mikobakteria, media nutrien pada asas agar dengan pelbagai bahan tambahan pertumbuhan dan penggunaan campuran gas khas telah dicadangkan. Untuk mendapatkan pertumbuhan mikobakteria pada media ini, semasa penanaman, suasana dengan kandungan karbon dioksida yang tinggi (4-7%) dicipta. Perincikan CO ₂ khusus digunakan untuk tujuan ini . Walau bagaimanapun, sistem automatik yang paling maju untuk penanaman mikobakteria: MGIT-BACTEC-960 dan MB / Bact.

Satu sistem itu - sistem MGIT (pertumbuhan mycobacteria menunjukkan tiub), yang merujuk kepada perkembangan teknologi tinggi dan dimaksudkan untuk diagnosis bakteriologi pesat batuk kering dan Mycobacterium kecenderungan kepada ubat-ubatan barisan pertama, dan beberapa ubat-ubatan barisan kedua. MGIT difokuskan untuk menggunakannya sebagai sebahagian daripada peranti VASTES-960. Mikroorganisma ditanam dalam tiub khas dengan medium nutrien cecair berdasarkan medium Middlebrook-7H9 yang telah diubahsuai. Untuk merangsang pertumbuhan mikobakteria dan menyekat pertumbuhan mikroflora luaran, Tambahan MGIT Growth dan campuran ubat antibakteria PANTA digunakan.

Pertumbuhan mikroorganisma dicatatkan secara optikal. Ia didasarkan pada pendarfluor, yang berlaku apabila oksigen dimakan oleh mycobacteria semasa pertumbuhan. Pewarna fluorochromik yang bergantung kepada oksigen didapati di bahagian bawah tiub ujian khas dan ditutup dengan lapisan silikon. Pembiakan mycobacteria membawa kepada penurunan dalam jumlah oksigen di dalam tiub dan mengurangkan kepekatan yang menyebabkan peningkatan dalam pendarfluor, yang akan kelihatan di bawah sinaran oleh tiub cahaya ultraungu dan photosensor automatik didaftarkan terbina dalam perkakas VASTES-960. Keamatan luminescence dicatatkan dalam unit pertumbuhan (GU-growth units). Data pertumbuhan dicatat di dalam komputer, di mana ia boleh disimpan secara automatik. Analisis komputer lengkung pertumbuhan boleh memberikan maklumat mengenai kehadiran pelbagai kolam Mycobacterium, termasuk nontubercular, dan juga membantu untuk menilai sifat-sifat pertumbuhan mycobacteria.

Hasil daripada pengenalan sistem sedemikian, masa untuk pertumbuhan mikobakteria menurun dengan ketara, purata 11 hari pada VASTES-960 dan 19 hari pada MB / Bact berbanding 33 hari pada medium nutrien padat standard. Perlu diingatkan bahawa sistem ini memerlukan kakitangan yang berkelayakan. Penaburan bahan pada media cecair semestinya disertai dengan penaburan pada media Levenstein-Jensen, yang memainkan peranan duplikator dalam kes-kes ketika mycobacterium tuberculosis tidak menimbulkan media lain.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Penentuan kepekaan ubat mikobakteria

Penentuan spektrum dan derajat kepekaan mikobakteria terhadap ubat anti-tuberkulosis adalah kepentingan klinikal yang hebat, serta untuk penilaian epidemiologi penyebaran tuberkulosis dengan rintangan dadah. Di samping itu, pemantauan rintangan dadah membolehkan untuk menilai keberkesanan program tuberkulosis secara keseluruhannya, sebagai penunjuk integral terhadap prestasi semua komponen aktiviti anti-tuberculosis.

Kepelbagaian dan masa kepekaan dadah:

• sebelum permulaan rawatan sekali untuk menentukan strategi dan taktik rawatan:
• apabila terpencil dari budaya berpenyakit dari pelbagai bahan (sputum, cecair BAL, air kencing, eksudat, minuman keras, dll.), semua strain terpencil diperiksa:
• pada akhir fasa intensif rawatan tanpa adanya dinamik klinikal dan radiologi:
• jika perlu untuk menukar rejimen rawatan dalam kes berikut:
  • ketiadaan cecair dada;
  • re-isolation of culture selepas sputum smear-negative;
  • peningkatan drastik dalam bilangan CMB dalam swab selepas penurunan awal. Adalah diketahui bahawa strain mycobacterium tuberculosis, yang heterogen dari segi kepekaan dadah, terpencil dari bahan dari pesakit dengan tuberkulosis. Kepekaan strain untuk ubat anti-tuberkulosis mungkin berbeza dalam spektrum ubat, darjah, kekerapan dan kadar berlakunya rintangan.

Tahap rintangan dadah Mycobacterium tuberculosis telah ditentukan mengikut kriteria yang ditetapkan, yang memberi tumpuan kepada kepentingan klinikal dan kestabilan bergantung kepada aktiviti dadah anti-TB, farmakokinetik kemuncak, kepekatan dalam lesi. Dos terapeutik maksimum dan sebagainya.

Penentuan kepekaan ubat mikobakteria kini dijalankan oleh kaedah mikrobiologi:

• Kepekatan mutlak (kaedah pengenceran pada media nutrien yang padat atau cecair),
• perkadaran,
• pekali rintangan.

Kebiasaannya, rintangan ditunjukkan dalam bentuk pertumbuhan penglihatan koloni mycobacterium tuberculosis, tetapi ada kaedah yang mendorong pertumbuhan pada peringkat awal pembahagian sel mikobakteria dalam bentuk reaksi warna. Kaedah ini memendekkan masa ujian 3-4 hingga 2 minggu.

Sebagai bersatu di Rusia telah dilanjutkan, yang disyorkan oleh kaedah kemoterapi Jawatankuasa WHO kepekatan mutlak, iaitu dari sudut metodologi pandangan, adalah yang paling mudah, tetapi ia memerlukan ketepatan tinggi dan keseragaman prosedur makmal. Ujian kerentanan dadah terdiri daripada satu set tiub ujian dengan medium nutrien diubahsuai dengan ubat anti-TB. Set ini terdiri daripada 2-3 tiub dengan kepekatan yang berbeza setiap satu daripada ubat yang digunakan, tiub satu kawalan tanpa dadah kepada alam sekitar dan satu tiub yang mengandungi 1000 mcg / ml natrium Sali tsilovokislogo atau 500 ug / ml paranitrobenzoynoy nontubercular asid untuk mengesan pertumbuhan mycobacteria.

Untuk menyediakan satu set media dengan persediaan, medium Levenstein-Jensen yang diubahsuai (tanpa kanji) digunakan, yang dicurahkan ke dalam kepingan. Dalam setiap kepingan, satu jumlah tertentu pencairan yang sesuai bagi penyediaan antituberculous ditambah. Kandungan botol dicampur dengan teliti, dicurahkan ke dalam tiub dan dilipat dalam kedudukan yang cenderung selama 40 minit pada suhu 85 ° C. Ia disyorkan untuk menggulungkan medium dalam penghilang elektrik dengan kawalan suhu automatik. Rabu dengan ubat anti-TB

Siri 1 boleh disimpan dalam peti sejuk pada 2-4 ° C selama 1 bulan, dengan persiapan baris kedua - tidak lebih dari 2 minggu. Penyimpanan media dengan persiapan pada suhu bilik tidak dapat diterima. Apabila menyediakan penyelesaian ubat-ubatan anti-tuberkulosis, aktiviti mereka diambil kira, mengira kepekatan disesuaikan untuk berat molekul bahagian tidak perseorangan penyediaan, kesucian, dan sebagainya. Untuk menentukan sensitiviti dadah, hanya bahan kimia yang tulen digunakan.

Prinsip kaedah ini adalah untuk menentukan kepekatan ubat antituberculous yang menghalang pertumbuhan sebahagian besar populasi mikobakteri. Sekiranya dilakukan dengan betul, kaedah ini mempunyai kebolehpercayaan yang baik.

Sebelum ujian, adalah perlu untuk memastikan bahawa budaya terpencil mycobacterium tuberculosis tidak mempunyai mikroflora yang melampau. Daripada budaya mycobacteria dalam 0.9% larutan natrium klorida disediakan penggantungan homogen yang mengandungi 500 juta badan mikrob dalam 1 ml (kekeruhan optik standard 5 unit). Bubur yang dihasilkan dicairkan dengan larutan natrium klorida 0.9% (1:10) dan 0.2 ml buburan ditambah pada setiap tiub set media kultur. Tiub dibiji diletakkan dalam termostat pada suhu 37 ° C dan disimpan dalam kedudukan mendatar selama 2-3 hari supaya permukaan cerun medium budaya diseragamkan secara seragam dengan penggantungan mycobacterium tuberculosis. Tiub kemudian dipindahkan ke kedudukan menegak dan diinkubasi selama 3-4 minggu. Hasilnya direkodkan selepas 3-4 minggu.

Memandangkan masa perkumuhan ekskresi dari bahan klinikal pada media nutrien adalah sekurang-kurangnya 1-1.5 bulan, keputusan menentukan kepekaan dadah dengan kaedah ini boleh diperolehi tidak lebih awal daripada 2-2.5 bulan selepas menyemai bahan. Ini adalah salah satu kelemahan utama kaedah ini.

Terangkan hasil penentuan kepekaan ubat mikobakteri berdasarkan kriteria tertentu. Pada media budaya pepejal dianggap sensitif kepada kepekatan ubat yang terkandung dalam jangka sederhana, jika bilangan koloni mycobacteria ditanam di vitro dengan ubat ini tidak lebih daripada 20 adalah dengan pertumbuhan yang banyak dalam tiub kawalan tanpa dadah. Hanya dengan kehadiran lebih daripada 20 koloni adalah budaya dianggap sebagai tahan terhadap kepekatan ini. Dalam praktiknya, apabila memperoleh pertumbuhan menghasilkan tiub ujian yang hampir 20 cfu. Adalah perlu untuk memberitahu unit klinikal bahawa sensitiviti atau rintangan dalam kes ini adalah sempadan, kerana kadang-kadang ia dapat menerangkan dinamik kabur penunjuk klinikal.

Bagi pelbagai ubat kepekatan tertentu ditubuhkan, di mana pembiakan bahagian kritikal populasi mikobakteri diperhatikan. Kepekatan ini dipanggil "kritikal". Sebagai kriteria kestabilan, pertumbuhan populasi mikobakteria pada medium nutrien dengan persiapan pada kepekatan kritikal digunakan.

Dalam amalan TB domestik, dalam menentukan rintangan dadah, mereka tidak terhad untuk menentukan hanya kepekatan kritikal. Ini disebabkan hakikatnya. Bahawa tahap definisi lanjutan rintangan dadah membolehkan doktor untuk meletakkan lebih tepat kemoterapi taktik menggunakan pengetahuan potentiating tindakan kombinasi ubat, menyilang rintangan dijangka atau untuk memohon kumpulan ubat-ubatan yang lebih berkesan menggunakan ubat-ubatan anti-TB.

Kaedah tumpuan mutlak adalah yang paling mudah, tetapi ia juga yang paling sensitif terhadap kesilapan yang dibuat apabila ia dilakukan. Lebih dipercayai, terutamanya dalam menentukan kepekaan terhadap ubat barisan kedua, dan biasa di luar Rusia adalah kaedah perkadaran. Ia mengambilkira kekurangan kaedah kepekatan mutlak, tetapi dalam pelaksanaannya lebih susah payah.

Kaedah ini sangat serupa dengan kaedah kepekatan mutlak. Penyediaan tiub ujian dengan ubat-ubatan dilakukan dengan cara yang sama. Seperti dalam kaedah kepekatan mutlak. Bagaimanapun, dos benih penggantungan mycobacterium tuberculosis dikurangkan dengan faktor 10. Yang menghilangkan frekuensi rintangan spontan beberapa strain mycobacterium tuberculosis kepada ubat seperti Etambutol, protionamide, capreomycin. Sebagai kawalan, 2 atau 3 tiub dengan dos benih yang sama dalam tiub ujian, 10 kali dan 100 kali dicairkan digunakan. Kriteria kestabilan adalah perkadaran pertumbuhan miokobacterium tuberculosis yang diperhatikan secara visual. Untuk ubat-ubatan siri 1, kriteria kestabilan adalah lebihan pertumbuhan 1% penduduk awal, untuk ubat barisan kedua - peningkatan 1 atau lebih daripada 10% daripada permulaan, bergantung kepada kepekatan kritikal yang dipilih.

Pada tahun 1997, satu kumpulan kerja daripada WHO dan Kesatuan Antarabangsa bagi mengenal pasti batuk kering baik rintangan dadah TB telah membuat penyesuaian terhadap kriteria ini, menawarkan penginapan yang dianggap mycobacteria tahan, yang tumbuh di media telur pepejal Lowenstein-Jensen pada kepekatan yang berikut:

• dihydrostreptomycin - 4 μg / ml;
• isoniazid 0.2 μg / ml:
• rifampicin 40 μg / ml:
• Ethambutol - 2 μg / ml.

Pada tahun 2001, kepekatan kritikal dicadangkan untuk ubat baris kedua berikut (untuk bahagian kritikal sebanyak 1%):

• capreomycin - 40 mcg / ml;
• protionamide - 40 mcg / ml;
• kanamycin - 30 μg / ml;
• viomycin - 30 mcg / ml;
• cycloserine 40 μg / ml;
• asid aminosalicylic - 0.5 μg / ml;
• ofloxacin - 2 μg / ml.

Hasil pertumbuhan dinilai setelah 4 minggu sebagai pendahuluan dan selepas 6 minggu penanaman - sebagai yang terakhir.

Untuk menentukan kepekaan dadah kepada pyrazinamide, yang digunakan secara meluas dalam kemoterapi moden untuk tuberkulosis, kepekatan kritikal yang disyorkan ialah 200 μg / ml. Walau bagaimanapun, sehingga kini tiada kaedah umum yang diterima untuk menentukan rintangan dadah terhadap ubat ini pada media nutrien pepejal, kerana aktiviti antibakterianya hanya ditunjukkan dalam medium berasid (pH <6), yang secara teknikalnya sukar untuk dikekalkan. Di samping itu, banyak budaya klinikal tuberkulosis mycobacteria dengan berat hati berkembang di persekitaran telur dengan persekitaran berasid.

Untuk menilai kualiti keputusan menentukan kepekaan ubat mikobakteria, disarankan agar setiap kumpulan baru media Levenstein-Jensen dipantau oleh penentuan selari sensitiviti ketinggian muzium standard H37Rv. Di samping itu, terdapat kriteria mikrobiologi tertentu yang mesti dikekalkan supaya teknik memberikan hasil yang dapat direproduksi dengan baik dan tepat. Ini termasuk daya maju budaya Mycobacterium tuberculosis, kaedah-kaedah untuk mendapatkan penggantungan dan penggantungan homogen budaya peraturan pemilihan Mycobacterium tuberculosis, yang kerepresentatifan jisim bakteria yang dipilih. Kebolehpercayaan penentuan rintangan ubat menurun dengan pembebasan bakteria yang sangat terhad.

Baru-baru ini, satu kaedah untuk menentukan kepekaan dadah menggunakan sistem automatik telah dianggap menjanjikan. Yang paling sempurna dalam bidang ini adalah perkembangan berdasarkan VASTES MGIT-960. Dalam kes ini, kepekaan ubat mycobacterium tuberculosis ditentukan berdasarkan kaedah perkiraan yang diubahsuai. Dalam proses penentuan, kadar pertumbuhan mycobacterium tuberculosis dalam tiub kawalan dan dalam tiub ujian dengan ubat telah dibandingkan. Untuk menentukan kepekaan kepada streptomycin, isoniazid, rifamp-picin dan etambutol, tambahan pengayaan dan antibiotik yang dimasukkan dalam kit SIRE digunakan. Untuk menentukan kepekaan terhadap pyrazinamide, gunakan kit PZA. Dalam perjalanan penggantungan ujian Mycobacterium tuberculosis disuntik tabung uji dengan dadah, serta tiub kawalan dengan penggantungan Reconstituted 100 kali untuk semua ubat-ubatan kecuali Pyrazinamide, di mana penggantungan adalah pencairan 10 kali. Kriteria kestabilan adalah penunjuk pertumbuhan mikobakteria sebanyak 100 GU apabila pertumbuhan dicapai dalam tiub kawalan 400 GU (lihat "Kaedah budaya untuk mengasingkan mikobakteria"). Perakaunan dan tafsiran hasil dijalankan secara automatik dan ditetapkan oleh input atau program yang dipilih.

Sebagai kepekatan kritikal, kepekatan akhir digunakan dalam tiub ujian dengan medium nutrien cecair. Pada masa ini, kepekatan kritikal telah dikembangkan untuk kedua-dua barisan kedua dan dadah kedua. Perlu diperhatikan bahawa sensitiviti tuberkulosis mycobakteria kepada cycloserine dan asid aminosalicylic hanya ditentukan pada media nutrien telur.

Satu protokol terperinci mengenai kerja pada sistem yang diterangkan memungkinkan untuk mengkaji kerentanan dadah baik pada budaya terpencil (dengan medium nutrien yang padat) dan menggunakan pertumbuhan primer mycobacterium dalam tiub MGIT. Pilihan kedua ketara mengurangkan masa untuk budaya, membolehkan anda untuk mendapatkan keputusan penuh budaya Mycobacterium tuberculosis (termasuk maklumat mengenai sensitiviti dadah) selepas 3 minggu dari tarikh kutipan bahan, manakala kaedah tradisional ia adalah mungkin untuk mendapatkan hanya bulan ke-3. Pada masa yang sama, keputusan yang diperoleh, apabila pesakit berada dalam fasa intensif rawatan, boleh membayar pampasan untuk kos penyelidikan yang agak tinggi.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Pembezaan mycobacteria

Dengan mengambil kira bahawa media nutrien yang digunakan tidak selektif. Pembezaan seterusnya mikobakteria terpencil diiktiraf sebagai wajib. Keperluan untuk pembezaan mycobacteria adalah disebabkan oleh beberapa ciri-ciri proses patologi yang disebabkan oleh genus: Kursus yang berbeza dan hasil batuk kering dan mycobacteriosis, kehadiran rintangan dadah semula jadi untuk beberapa ubat-ubatan anti-TB.

Ia diakui bahawa pengenalan utama Mycobacterium tuberculosis kompleks M. Nontubercular dari mycobacteria dilakukan oleh ciri-ciri berikut: kadar pertumbuhan pada media pepejal nutrien, pigmentasi, tanah jajahan morfologi, kehadiran rintangan asid dan pertumbuhan optimum suhu.

Malangnya, tidak ada kaedah makmal tunggal untuk pasti membezakan M. Batuk kering mycobacteria kompleks dari riba asid-segera yang lain, namun gabungan ciri-ciri yang dinyatakan di atas dengan keputusan yang diberikan di bawah beberapa ujian biokimia membolehkan pengenalpastian kompleks Mycobacterium tuberculosis dengan M. Mungkin 95%.

Untuk pembezaan Mycobacterium kompleks M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii dan lain-lain) dari mycobacteria berkembang perlahan digunakan nontubercular ujian asas biokimia yang mengesan kehadiran gejala berikut:

• keupayaan untuk menghasilkan asid nikotinik (ujian niacin):
• aktiviti nitrat reduktase;
• catalase termostable;
• pertumbuhan pada medium dengan natrium salisilat (1 mg / ml).

Sebagai ujian tambahan, pertumbuhan pada medium yang mengandungi 500 μg / ml asid paranitrobenzoic atau 5% natrium klorida juga boleh digunakan.

Banyak makmal bakteriologi mengenal pasti mikroorganisma ini hanya di peringkat kompleks, yang disebabkan oleh keupayaan terhad makmal dan keupayaan metodologi pakar.

Dalam kebanyakan kes, bagaimanapun, dalam amalan untuk membezakan M. Batuk kering dan M. Bovis mencukupi ujian berikut: niasin, kehadiran nitrat, pendaftaran kehadiran dan pertumbuhan pirazinamidazy dalam medium yang mengandungi 2 ug / ml hydrazide asid thiophene-2-karboksilik. Ia diambil kira bahawa mikobakteria kompleks M. Tuberculosis dicirikan oleh set aksara berikut:

• pertumbuhan perlahan (lebih daripada 3 minggu);
• suhu pertumbuhan dalam lingkungan 35-37 ^o C;
• ketiadaan pigmentasi (gading);
• warna asid-cepat ditandakan;
• ujian niacin positif;
• ujian positif reduktase nitrat;
• ketiadaan katalase termostable (68 ^° C).
• Ketiadaan pertumbuhan pada media Levenstein-Jensen yang mengandungi:
  • 1000 μg / ml natrium salisilat,
  • 500 μg / ml asid paranitrobenzoik,
  • 5% natrium klorida:
• pertumbuhan dengan kehadiran 1-5 μg / ml asid thiophene-2-carboxylic.

Perkaitan pembedahan mycobacteria terpencil akan meningkat dengan ketara dengan peningkatan frekuensi merekam kes HIV / AIDS yang berkaitan dengan tuberkulosis atau mycobacteriosis. Pada masa ini, tidak ada kepastian mutlak kesediaan makmal serantau praktikal untuk melaksanakan jilid kerja dengan betul.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Diagnosis imunologi tuberkulosis

Terdapat beberapa fenomena sejagat, ubat-ubatan dan ujian imunologi yang pada mulanya dijumpai dengan tepat dengan tuberkulosis atau pada model tindak balas imun terhadap mikobakteria. Ini termasuk BCG Tuberculin, seperti satu fenomena seperti kulit DTH (tuberculin - Pirquet dan Mantoux tindak balas), tindak balas kepada haiwan tuberculin sensitif subkutaneus (Koch fenomena). Salah satu antibodi pertama dalam penyakit berjangkit juga dikesan dalam tuberkulosis. Sudah tentu, pemahaman lebih mendalam tentang mekanisme imuniti antituberculous dan kawalan genetik mereka, lebih luas mungkin penggunaan kaedah imunologi dan ubat-ubatan yang mempengaruhi imuniti untuk menyelesaikan masalah praktikal fisiologi.

Masalah praktikal yang paling penting dan sukar kini dianggap pengesanan tuberkulosis dalam proses penyaringan massa penduduk. Walau bagaimanapun, walaupun terdapat banyak laporan tentang "kejayaan" (atas bahan yang terhad), tiada kaedah imunologi yang sesuai (diterbitkan dalam "mana-mana senjata") dan ubat yang sesuai untuk tujuan ini.

Kaedah imunologi, terutamanya kajian serologi (penentuan antigen, antibodi) dan ujian penekanan tuberkulin sangat banyak digunakan dalam amalan klinikal.

Di tempat pertama di kalangan kajian imunologi yang digunakan dalam diagnosis pembezaan, terdapat kaedah serologi - penentuan antigen dan antibodi dalam persekitaran yang berlainan badan.

Kekhususan antibodi kepada tuberkulosis mycobacteria bergantung kepada antigen yang digunakan dalam immunoassay. Sebilangan besar antigen dicadangkan, yang pertama adalah tuberculin PPD:

• PAP dan persiapan kompleks lain dari cecair budaya;
• perpecahan ultrasonik;
• Ekstrak triton dan persiapan kompleks dinding sel;
• 5-antigen (Daniel);
• 60-antigen (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• faktor kord (trehalose-6,6-di-mycollate);
• fenolik dan glikolipid lain;
• lipopolysaccharides;
• antigen yang mengikat fibronektin;
• protein (paling sering rekombinan); 81.65,38,34,30,19,18,16,15.12 CDA, dsb.

Akibat banyak tahun penyelidikan oleh ahli sains Rusia dan asing, corak pembentukan antibodi utama dan keberkesanan diagnosis serologi tuberkulosis telah diturunkan: antigen yang lebih kompleks, semakin tinggi kepekaan dan kekhususan yang lebih rendah daripada ujian. Spesifikasi berbeza-beza dari negara ke negara bergantung kepada jangkitan penduduk dengan M. Tuberculosis dan mycobacteria bukan tuberculosis, dari vaksinasi BCG, dan lain-lain. Pada kanak-kanak, nilai informatif serodiagnosis lebih rendah daripada orang dewasa. Dalam batuk kering utama (lebih kerap kanak-kanak), definisi IgM lebih bermaklumat. Dengan IgG sekunder. Dalam pesakit yang dijangkiti HIV, nilai serodiagnosis yang bermaklumat dalam menentukan antibodi dikurangkan. Kecekapan penentuan antibodi bergantung kepada bilangan "aspek klinikal": aktiviti proses (kehadiran atau ketiadaan pereputan kehadiran "pengasingan" mycobacteria rongga, tahap penyusupan), kelaziman proses, tempoh alirannya.

Kepekaan kaedah enzyme immunoassay (ELISA) adalah kira-kira 70%. Keberkesanan kajian tidak mencukupi disebabkan kekhususannya yang rendah. Sebelum ini, kemungkinan menggunakan saringan serologi dalam kumpulan berisiko tinggi, khususnya di kalangan orang yang mengalami perubahan selepas tuberkulosis dalam paru-paru, telah dipertimbangkan.

Untuk meningkatkan kekhususan ELISA, mencari antigen yang lebih spesifik, termasuk yang diperolehi oleh kejuruteraan genetik: ESAT-6, dan sebagainya (lihat di atas) terus. Penggunaan antigen yang ketat (38 kDa, ESAT) meningkatkan kekhususan. Tetapi ketara mengurangkan sensitiviti analisis. Bersama-sama dengan IFA (sistem ujian makmal eksperimen. Cth Pathozyme ELISA kit) juga menyediakan kit dengan penapisan sisi immunochromatographic (Mycodot), serta ujian sama lain (dot-analisis pada membran) dengan penilaian visual keputusan ujian. Semasa ujian ini, analisis dilakukan selama 10-30 minit; mereka tidak memerlukan peralatan khas, mereka memerlukan penilaian visual hasil, yang dikaitkan dengan subjektivitas tertentu. Kaedah ini mempunyai kira-kira kepekaan yang sama dan ciri khusus (70% dan 90-93%, masing-masing) sebagai ELISA tradisional.

Penggunaan kaedah analisis imun mempunyai nilai yang pasti sebagai tambahan, diambil kira dalam kompleks kaedah yang digunakan, dalam diagnosis pembezaan tuberkulosis, terutamanya dalam diagnosis bentuk ekstrapulmonarinya. Kaedah ELISA yang paling berkesan adalah dalam diagnosis meningitis tuberkulosis dalam kajian cecair serebrospinal. Dalam kes ini, sensitiviti analisis adalah 80-85%, dan kekhususan adalah 97-98%. Terdapat data mengenai keberkesanan pengesanan antibodi kepada tuberkulosis mycobacteria dalam cecair air mata dalam diagnosis uveitis tisu.

Induksi gamma interferon synthesis in vitro

Gamma interferon (IFN-γ) adalah faktor pertahanan imun spesifik yang disedari dengan mengaktifkan sistem enzim makrofag. Penginduksi sintesis IFN-γ oleh T-limfosit yang sensitif menyebabkan interaksi dengan antigen mikobakteria.

Sebagai antigen digunakan sebagai PPD tuberculin. Dan antigen tertentu, yang diperolehi oleh kejuruteraan genetik, dalam antigen tertentu ESAT-6 (awal dirembeskan antigen yang mempunyai berat molekul 6 kDa) dan CFP-10 (budaya turasan protein 10 kDa). Kejuruteraan genetik atau antigen rekombinan tidak hadir dalam sel-sel vaksin BCG dan lain-lain mikobakteria. Apabila menggunakan tuberculin, keputusan ujian induksi IFN-γ adalah sebanding dengan keputusan ujian kulit tuberculin (korelasi langsung). Apabila menggunakan antigen rekayasa genetik, hasil ujian lebih spesifik dan tidak bergantung kepada vaksinasi BCG sebelumnya. Apabila menguji orang yang diberi vaksin yang tidak mempunyai jangkitan jangkitan tuberkulosis, spesifikasi ujian adalah 99%. Kepekaan ujian di kalangan pesakit dengan batuk kering bervariasi dari 81 hingga 89%.

Ujian dan alat-alat diagnostik telah dibangunkan berdasarkan penanaman jangka pendek sel atau sel-sel mononuklear darah keseluruhan diasingkan daripada darah dengan antigen Mycobacterium tuberculosis in vitro dengan penentuan berikutnya kepekatan IFN-γ atau dengan mengira jumlah T-limfosit yang mensintesis IFN-γ. Kepekatan interferon yang disintesis dalam tiub ujian ditentukan oleh ELISA menggunakan antibodi monoklonal yang mengikat IFN-γ. Kemudian, dengan menentukur standard IFN-γ, kepekatannya ditentukan dalam tiub ujian atau telaga plat.

Apabila menjalankan ujian Elispot, bilangan T-limosit yang mensintesiskan IFN-γ. Dikira pada permukaan plat yang disalut dengan antibodi kepada IFN-γ.

Pemaju diagnostik berdasarkan induksi IFN-γ in vitro, yang diluluskan oleh Badan Perubatan dan Produk AS, berpendapat bahawa tidak mungkin untuk membedakan jangkitan tuberkulosis laten dari tuberkulosis aktif dengan bantuan ujian. Oleh itu, di kawasan yang mempunyai tahap jangkitan yang tinggi, ujian itu tidak secara langsung diagnostik. Walau bagaimanapun, di negara kita ia boleh digunakan untuk membezakan jangkitan tuberkulosis pada kanak-kanak dari alahan pasca-vaksinasi, dan untuk menilai tahap imuniti tertentu dalam proses rawatan.

Pada masa ini, sistem ujian domestik untuk menentukan induksi sintesis IFN-γ oleh antigen tuberkulosis tertentu dalam vitro sedang dikaji.

Status imun dan perjalanan tuberkulosis, ketahanan imun

Dalam proses rawatan tuberkulosis pada manusia, terdapat perubahan dalam antigenemia dan keadaan sistem kekebalan tubuh.

Data mengenai perubahan dalam eksudat dan tisu sebahagian besarnya bercanggah. Satu-satunya perkara yang boleh diperhatikan dengan sebab yang baik adalah bahawa dalam granuloma berubi, sebagai peraturan, sejumlah besar limfosit T yang aktif dikesan.

Adalah masuk akal untuk memikirkan dua lagi peruntukan yang perlu untuk memahami peranan mekanisme imunologi dalam rawatan batuk kering pada manusia:

• Pesakit AIDS mempunyai kejadian rintangan ubat yang sangat tinggi;
• dengan pelbagai rintangan dadah (dan jika tiada jangkitan HIV), gangguan imuniti (terutamanya pautan sel T) amat penting.

Apabila batuk kering meluas menggunakan pelbagai kaedah immunomodulation: ia adalah terutamanya dadah bertindak terutamanya kepada imuniti T-sel dan sistem fagosit mononuklear (hormon thymic, isophorone, likopid, polioksidony et al.). Serta mikobakteria keseluruhan (dilemahkan) dan komponennya.

Diagnosis molekular-biologi tuberkulosis

Untuk kaedah biologi molekul dalam diagnosis penyakit berjangkit termasuk, terutamanya, kaedah berdasarkan memanipulasi dengan bahan genomik patogen bakteria dan virus untuk mengenal pasti bahan genetik tertentu - segmen DNA yang mempunyai urutan nukleotida tertentu untuk jenis atau patogen tertentu strain untuk menganalisis tertentu Susunan DNA dalam gen yang menentukan kepekaan patogen kepada bahan ubat tertentu, dan juga untuk analisis fungsi aktiviti gen tertentu patogen. Teknik biologi molekul adalah secara meluas dalam penyelidikan saintifik dan aplikasi praktikal dalam diagnosis dan pemantauan pelbagai jangkitan bakteria dan virus selepas merasmikan pada tahun 1985, Carrie Myullisom (pemenang Hadiah Nobel. 1989) tindak balas rantai polimerase.

Prinsip dan kemungkinan kaedah tindak balas rantaian polimerase

PCR membolehkan untuk menguatkan (membiak) in vitro urutan nukleotida (fragmen DNA patogen) selama beberapa jam dalam berjuta-juta kali. Reaksi dalam kehadiran rantai DNA tunggal menentukan kepekaan yang tinggi terhadap ujian tersebut.

Urutan nukleotida sesetengah kawasan dalam rantai DNA menentukan identiti genetik mikroorganisma, yang menerangkan kekhususan PCR yang tinggi.

Nilai teknik ini untuk mengesan dan siasatan daripada ciri-ciri yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis ciri-ciri biologi mikroorganisma yang mempunyai pertumbuhan yang sangat perlahan: dua kali ganda masa Mycobacterium tuberculosis DNA apabila pengkulturan adalah 12-24 jam.

Prinsip kaedah PCR terdiri daripada amplifikasi - berganda, berjuta-juta kali. Mendarabkan seksyen urutan DNA tertentu dalam mikrofolum tiub semasa pengulangan kitaran tiga peringkat tindak balas yang berikut, masing-masing melepasi rejim suhu yang berbeza:

• Peringkat I - denaturation DNA double-stranded pada pemanasan dengan perbezaan rantainya;
• Tahap II - mengikat pelengkap (hibridisasi) primers (priming oligonucleotides) dengan bahagian terminal rantai yang sangat khusus, dipilih untuk pendaraban fragmen DNA;
• Tahap III - penyelesaian rangkaian serpihan DNA menggunakan polimerase DNA termostable.

Untuk penguatan in vitro, mesti ada molekul DNA matriks. Empat jenis deoxynucleoside triphosphates (nukleotida) yang mengandungi asas nitrogenous yang berkaitan: adenine (A), timin (T), guanine (D), sitosin (C); buatan sintetik buatan oligonukleotides (primers) yang terdiri daripada 18-20 pasang asas; thermostable enzim polimerase DNA mempunyai optimum suhu 68-72 ^pada C, dan ion magnesium.

Kekhususan PCR bergantung pada pilihan fragmen DNA. Selaras dengan ini, unggas oligonucleotides disintesis. Spesifikasi hibridisasi dan penyempurnaan rangkaian DNA adalah disebabkan oleh prinsip pelengkap pasangan basa nitrogen yang berikut: adenine-thymine, guanine-cytosine.

Untuk menentukan genomik kompleks mycobacteria bersakit paling berkesan sasaran penguatan dalam kebanyakan sistem ujian pilihan serpihan DNA IS6110, yang dalam kebanyakan strain Mycobacterium tuberculosis genom mempunyai sejumlah besar (10-20) ulangan, yang menyediakan, bersama-sama dengan kekhususan, kepekaan yang tinggi untuk cerakin. Pada masa yang sama strain Mycobacterium tuberculosis dengan sebilangan kecil ulangan atau ketiadaan fragmen IS6110 dijelaskan.

Pengasingan molekul DNA dari sampel biologi

Untuk menjalankan PCR, molekul DNA patogen harus diasingkan dari bahan biologi dalam jumlah minima, dengan jumlah minimum DNA tidak spesifik dan pelbagai inhibitor DNA polimerase enzim.

Penyediaan sampel perlu dijalankan di bawah keadaan yang menghalang pencemaran silang sampel oleh molekul DNA terpencil. Untuk melakukan ini, pra-rawatan bilik dengan ultraviolet, lantai dan permukaan kerja meja dan peralatan diperlukan dengan penyelesaian yang mengandungi klorin. Juga wajib menggunakan sarung tangan bersih, tiub ujian pakai buang dan tips untuk pipet automatik.

Untuk mengasingkan DNA Mycobacterium tuberculosis daripada spesimen klinikal (cecair serebrospina, Basuh bronkial) tidak mengandungi sebilangan besar sel-sel, serpihan selular, atau garam daripadanya, mencukupi untuk centrifuge sampel pada 3-4 ribu. Rpm, menambah enapcemar 20-30 ul sebanyak 2% penyelesaian triton X-100 dan dihangatkan pada 90 ^mengenai C selama 30 min.

Untuk penyediaan sampel sputum, pencairan berkesan diperlukan, yang mana penyelesaian 4% natrium hidroksida dan N-asetil-L-sistein (NALC) biasanya digunakan dalam jumlah 50-80 mg setiap sampel, bergantung kepada kelikatan sampel. Penyelesaian NALC mesti disediakan bekas tempore atau serbuk NALC boleh ditambah kering kepada sampel secara langsung. Selepas pencairan, sampel hendaklah disentri selama 15 minit pada 3.5-4,000 rpm (3000 g) dalam 50 ml botol dengan topi skru, i E. Di bawah keadaan yang sama yang disyorkan untuk penyediaan preskripsi kahak.

Untuk pengekstrakan DNA dari kaedah pelet yang paling kerap digunakan berdasarkan penggunaan penyelesaian 5-6 molar guanidine isothiocyanate lysis reagen sebagai zarah microporous dan oksida silikon ( "tanah diatom") sorbing molekul DNA. Bahan-bahan tidak spesifik, termasuk perencat mungkin, kemudian dibasuh dalam larutan 2.5 molar isothiocyanate guanidinium dan penyelesaian etanol, selepas itu molekul DNA itu desorbed dalam air, dan sampel ini digunakan untuk melaksanakan PCR. Untuk memudahkan teknologi pengekstrakan DNA, "bumi diatom" sering digantikan oleh microparticles magnetik yang disalut dengan oksida silikon. Dalam kes ini, pendirian magnet khas untuk microtubes digunakan dan bukannya sentrifugasi untuk mendakan zarah.

Di Rusia, kaedah asal untuk pemisahan mikrobakteria immunomagnetic telah dibangunkan, diikuti dengan pengekstrakan DNA patogen. Untuk Mycobacterium tuberculosis pemisahan immunomagnetic menggunakan saiz ferroparticles 3-5 mikron, disalut dengan silika, yang dilampirkan oleh polyclonal ikatan kimia (rabbit) antibodi untuk Mycobacterium tuberculosis. Sampel sputum selepas lisis alkali dinentralisasi dengan larutan tris-HCl berasid dan diinkubasi dengan sorben immunomagnetik. Kemudian, immunoferroparticles dikumpulkan dengan rod magnet dengan hujung diganti, dipindahkan ke microtube, dan precipitated. Tambah 20-30 μl daripada penyelesaian Triton X-100 2% dan panas selama 30 minit pada 90 ^° C. Supernatan digunakan sebagai templat DNA untuk analisis PCR.

Masalah yang sukar ialah pengasingan DNA mycobacterium tuberculosis dari spesimen biopsi. Untuk biopsi enzim, enzim proteinase K digunakan pada kepekatan akhir 200-500 mg / l pada suhu 56 ^° C dalam sekelip mata. Selanjutnya, salah satu kaedah yang diketahui digunakan. DNA nonspesif kelebihan dalam analisis PCR biopsi sering menyebabkan perencatan tindak balas yang memerlukan pengekstrakan DNA berulang.

Kaedah untuk mengesan keputusan

Setelah selesai tindak balas, serpihan DNA amplified patogen dikenal pasti oleh pelbagai kaedah.

Kaedah elektroforesis gel diketahui dengan baik. Serpihan DNA yang dihasilkan dikenal pasti oleh kawalan positif yang mengandungi fragmen DNA spesifik yang dikehendaki, atau mengikut saiz yang diketahui (bilangan pasangan nukleotida) serpihan, yang ditentukan menggunakan penanda molekul piawai.

Dengan kehadiran pewarna tertentu, etidium bromida dimasukkan ke dalam DNA double-stranded. Fragmen DNA yang disintesis dikesan sebagai band yang bercahaya di bawah tindakan ultraviolet.

Saiz serpihan DNA, ditentukan oleh elektroforesis dari jarak dari permulaan, mesti sesuai dengan penanda berat molekul yang diketahui atau kawalan positif.

Kaedah-kaedah lain untuk menentukan keputusan PCR berdasarkan penghibridan satu rantaian produk PCR dengan oligonucleotide pelengkap dengannya - DNA siasatan diberi label dengan biotin, diikuti dengan pengesanan melalui tindak balas enzim, contohnya dengan mengikat kepada streptavidin-Biotin phosphatase alkali.

Berdasarkan jenis pengesanan ini, penganalisis PCR telah diwujudkan di mana pengesanan keputusan PCR dijalankan secara automatik sebagai hasil daripada membaca kepadatan optik dalam sampel selepas manifestasi tindak balas enzimatik.

Kelemahan kaedah ini adalah kemungkinan pencemaran intralaboratori oleh sebilangan kecil molekul DNA yang agak pendek. Apabila molekul memasuki sampel baru, mereka menjadi matriks untuk PCR dan membawa kepada hasil positif palsu.

Dalam hal ini, untuk mengelakkan keputusan positif palsu, peraturan yang ketat untuk pemisahan dan pengasingan premis diperkenalkan: untuk mengambil DNA dari sampel biologi; premis untuk mengesan hasil (elektroforesis) dari zon bersih. Premis ini adalah zon pencemaran yang mungkin. Satu lagi kawasan terpencil adalah ruang yang bersih untuk memperkenalkan sampel DNA yang akan diuji dalam tiub dengan campuran reaksi untuk PCR. Akhirnya, diandaikan bahawa peranti utama - penguat DNA - harus diletakkan di ruang yang berasingan, mungkin pejabat, bilik.

Untuk mengelakkan pencemaran produk tindak balas sebelumnya - beberapa ujian sistem Likon-amp PCR bukannya dezoksinukleozidtimidina mengandungi dezoksinukleoziduridin yang apabila in vitro sintesis litar diperbadankan bukannya dalam kedudukan yang betul, iaitu, Asas nitrogen yang terdapat di thymine hadir dalam DNA asli digantikan oleh uracil. Urasil DNA glycosylase ditambah kepada campuran tindak balas kepada analit, memusnahkan hanya mencemarkan serpihan deoxyuridine, tetapi tidak DNA speakers dianalisis. Lt; / RTI & gt; Pemanasan seterusnya pada 94 ^° C tidak mengaktifkan enzim ini dan tidak mengganggu penguatan dalam PCR.

Terdapat sistem ujian berdasarkan amplifikasi isoterma rRNA, yang mana transkripsi dan sintesis DNA molekul terbalik dijalankan terlebih dahulu. Yang, pada gilirannya, adalah matriks untuk sintesis berikutnya RNA molekul. RNA amplicons dikesan menggunakan probe DNA berwarna acridine apabila hibridisasi dalam penyelesaian tiub reaksi. Kaedah ini, sebagai tambahan kepada sensitiviti yang tinggi, mempunyai kelebihan menganalisis dalam satu tiub, yang menghalang pencemaran. Menurut penulis, sensitiviti kaedah ini dalam sampel pernafasan mencapai 90% dengan kekhususan 99-100%.

Kaedah pengesanan baru dilaksanakan dalam PCR masa nyata. Kaedah ini berbeza terutamanya dalam PCR dan pengesanan keputusannya dilakukan serentak dalam satu tiub tertutup. Ini bukan sahaja mempermudah teknologi analisis, tetapi juga menghalang pencemaran bilik makmal dan sampel ujian dengan produk PCR terdahulu.

Dalam masa nyata keputusan pengesanan PCR adalah disebabkan oleh pendarfluor berlaku semasa fluorogenic penghibridan siasatan DNA dengan amplifitsi Rui-PCR semasa serpihan DNA tertentu. Struktur probe DNA fluorogenic dibina supaya penanda kalimantang dilepaskan akibat daripada tindak balas enzim atau menjauhkan dari alat bomba molekul pendarfluor hanya di bawah penghibridan tertentu dengan molekul DNA yang dikehendaki untuk dikuatkan dalam PCR. Sebagai bilangan molekul siasatan hybridized dengan peningkatan dalam pendarfluor adalah berkadar dengan tahap yang dikesan bilangan molekul produk dikuatkan. Kerana pada setiap nombor kitaran PCR molekul serpihan DNA didarab dengan separuh, bilangan kitaran di mana pendarfluor ini telah dipilih dan meningkatkan berkadar songsang dengan bilangan molekul DNA dalam sampel awal. Jika tindak balas adalah untuk memperkenalkan sebagai calibrator beberapa kepekatan yang diketahui yang berbeza molekul sepadan serpihan DNA Mycobacterium tuberculosis, menggunakan program komputer boleh dikira dan jumlah DNA genomik dalam bahan ujian.

Setiap sampel standard diduplikasi. Kriteria kuantitatif adalah bilangan minimum kitaran PCR yang diperlukan untuk permulaan dan pertumbuhan pendarfluasan yang ditentukan. Pada abscissa - bilangan kitaran; ordinat adalah nilai pendarfluor. Kepekatan DNA berkadar songsang dengan bilangan kitaran yang diperlukan untuk penampilan pendarfluor. Di lajur kanan (21-32), nombor kitaran untuk kepekatan yang sama ditandakan. Perbezaan antara kepekatan 10 kali ganda serpihan DNA 10 ² -10 ⁶ ml - 3.2-3.4 kitaran. Bagi dua pesakit, kepekatan fragmen IS6110 adalah kira-kira 10 ³ / ml dan 10 ⁴ / ml. Mengambil kira bilangan ulangan (6-20) serpihan yang dianalisis dalam genom Mycobacterium tuberculosis, jumlah myco-bakteria dalam sampel klinikal adalah kira-kira 100 dan 1000 sel.

Penggunaan PCR dalam diagnosis tuberkulosis

Kaedah PCR paling banyak digunakan untuk diagnosis dipercepatkan tuberkulosis - pengesanan mycobacterium tuberculosis dalam spesimen klinikal: dahak. Pengairan bronkial, exudate pleura, air kencing, cecair cerebrospinal, osteolysis punctate, aspirat saluran kemaluan wanita dan pelbagai spesimen biopsi. Dalam kajian di Belanda kira-kira 500 kahak dan lavage bronkial sampel dari 340 pesakit dengan diagnosis disahkan batuk kering telah dikaji untuk membandingkan sensitiviti kaedah PCR, mikroskop dan kajian budaya calitan. Kepekaan analisis masing-masing adalah 92.6.88.9 dan 52.4%. Kekhususan semua kaedah adalah kira-kira 99%.

Perbandingan kecekapan pengesanan Mycobacterium tuberculosis kaedah smear mikroskop, mengikut kekuatan pada Lowenstein-Jensen sederhana, sistem ujian VASTES dan analisis PCR. PCR menunjukkan sensitiviti sebanyak 74.4%, mikroskopi - 33.8%, pembajaan pada medium padat - 48.9% dan VASTES - 55.8%. Masa pengesanan purata untuk pembenihan pada media Levenstein-Jensen adalah 24 hari. VASTES - 13 hari, PCR - 1 hari.

Kemungkinan menggunakan PCR sebagai kaedah sensitif dan pantas untuk memantau keberkesanan rawatan TBC juga dibincangkan.

Pengesanan DNA Mycobacterium tuberculosis oleh PCR dengan kemoterapi berkesan ditentukan dari masa ke masa yang lebih lama - secara purata 1.7 bulan berbanding dengan smear yang ditakrifkan di bawah mikroskop pendarfluor, dan sebanyak 2.5 bulan berbanding dengan peperiksaan bakteriologi.

Diagnosis bentuk tuberkulosis extrapulmonary

Kepentingan PCR sebagai kaedah sensitif amat baik untuk bentuk ekstrapulmonari, kerana dengan bentuk-bentuk ini kaedah klinik-radiologi dan kaedah bakteriologis tradisional untuk menentukan mikobakteria tuberkulosis dalam bahan diagnostik tidak berkesan.

Dalam kajian sampel air kencing, keputusan analisis PCR adalah positif dalam 16 daripada 17 pesakit dengan tuberkulosis aktif sistem kencing dan negatif dalam 4 pesakit dengan batuk kering ginjal dan 39 pesakit dengan penyakit tidak berstatus sistem kencing.

Keberkesanan analisis PCR dalam kajian aspirin sumsum tulang pada pesakit dengan demam asal tidak diketahui ditunjukkan dalam kes-kes yang disyaki batuk kering. Untuk mendiagnosis limfadenitis tabung, 102 aspirat luka dan spesimen biopsi 67 kanak-kanak yang disyaki limfadenitis tabiat telah dikaji pada kanak-kanak. Hasil positif diperolehi: 71.6% PCR masa nyata. Mikroskop pendarfluor - 46.3%. Penyelidikan budaya - 41,8%. Dalam kajian 50 biopsi nodus limfa pada pesakit dengan "penyakit gatal", semua keputusan adalah negatif. Oleh itu, kepelbagaian 100% analisis PCR ditunjukkan. Dalam kerja yang sama, dengan biopsi tisu nodus limfa, kemungkinan pengesanan M. Avium ditunjukkan.

Diagnosis tuberkulosis kemandulan kawasan genital wanita, seperti yang diketahui, adalah salah satu masalah diagnosis yang paling sukar. Dalam kajian PCR terhadap biopsi endometrium, aspirat endometrium dan sampel cecair dari ruang Douglas, 14 (56%) daripada 25 pesakit yang diperiksa laparoskopi dengan suspek tuberkulosis menerima keputusan positif. Menggunakan mikroskopi dan budaya smear, masing-masing 1 dan 2 hasil diperolehi. Kes-kes ini juga positif PCR. Kebanyakan keputusan PCR positif berkaitan dengan kes-kes yang mempunyai tanda-tanda ciri tuberkulosis mengikut kajian histologi; sebilangan kecil - dengan disyaki batuk kering mengikut data laparoskopi. Hanya satu keputusan positif analisis PCR yang diperolehi dengan ketiadaan data laparoskopi untuk tuberkulosis.

Apabila mendiagnosis bentuk tuberkulosis ekstrapulmonary, klinik sering mempunyai persoalan tentang kemungkinan mengesan patogen apabila menguji sampel darah dengan kaedah PCR. Data sastera menunjukkan bahawa pengesanan DNA dari mycobacterium tuberculosis dari sampel darah adalah mungkin dengan jangkitan jangkitan HIV yang luas. DNA mycobacterium tuberculosis dikesan hanya dengan tuberkulosis umum pelbagai organ pada pesakit dengan buah pinggang dan imunosuppression yang ditransplantasikan.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Pengenalpastian spesies mikobakteria

Kaedah PCR boleh agak berkesan untuk pengenalan pesat mycobacteria kompleks batuk kering dan beberapa spesies mycobacteria nontubercular selepas menerima pertumbuhan awal mereka. Dalam kes ini, penggunaan PCR boleh menjimatkan 7-10 hari, yang diperlukan untuk mengenal pasti kebudayaan seterusnya hasil positif. Ujian PCR secara teknikalnya sangat mudah, kerana ia tidak memerlukan penyediaan sampel rumit bahan klinikal untuk mencapai kepekaan yang tinggi. Dalam kajian 80 positif dalam sistem ujian ini (syarikat MB Vasto. Organon) semua budaya positif PCR adalah ketat tertentu dan diadakan selama 1 hari. Untuk mengenal pasti spesies lain mycobacteria dalam penyediaan DNA budaya patogen hybridized dengan probe DNA tertentu diberi label dengan acridine dan tekanan dikesan oleh kemunculan chemiluminescence melalui chemiluminometer atau nitroselulosa jalur dengan penilaian visual selepas penghibridan. Dengan bantuan set itu, bilangan spesies yang terhad dikenalpasti: kompleks mycobacterium tuberculosis. M. Avium, M. Avium complex, M. Kansasii dan M. Gordonae.

A.Telenti et al. Juga membangunkan satu kaedah yang agak mudah dan murah pengenalan spesies spesies klinikal penting mycobacteria oleh PCR dan rawatan berikutnya dengan dua enzim sekatan (enzim mempunyai ciri-ciri memotong molekul DNA di tempat-tempat tertentu). Potongan DNA dikuatkan. Pengekodan protein kejutan haba (65 kDa), dan kemudian dirawat di serpihan PCR DNA yang terhasil daripada 439 pasangan nukleotida berasingan dua enzim - Bste II dan Hae III. Kemudian dianalisis dengan menggunakan agarose gel elektroforesis diperolehi dua produk, menentukan saiz mereka (bilangan pasangan bes) menggunakan satu set standard serpihan DNA (molekul DNA-penanda) panjang 100-1000 pasangan bes. Dalam setiap satu daripada jenis tertentu (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) mengesan dua atau tiga serpihan DNA saiz yang berbeza untuk setiap enzim sekatan. Kombinasi pelbagai saiz DNA yang diperoleh membolehkan membezakan spesies ini di kalangan mereka.

Teknologi microarrays DNA biologi sedang dibangunkan. Yang akan membantu mengenal pasti lebih daripada 100 spesies mycobacteria dalam satu kajian.

Pengenalpastian spesies juga boleh dilakukan oleh amplifikasi PCR bagi rantau pembolehubah rRNA 16S diikuti oleh penjujukan amplicon apabila dibandingkan dengan struktur utama yang sepadan, yang membolehkan mengenal pasti lebih daripada 40 spesis mikobakteria.

Dengan bantuan PCR, pengenalan spesies dalam kompleks mycobacterium tuberculosis juga boleh dilakukan, termasuk pembezaan M. Bovis dan M. Bovis BCG. Untuk melakukan ini, kehadiran atau ketiadaan beberapa gen di kawasan genom RD1 dianalisis. RD9 dan RD10. RD1 tidak hadir dalam M. Bovis BCG, tetapi terdapat dalam spesies yang ganas, termasuk M. Bovis.

Penentuan kepekaan ubat Mycobacterium tuberculosis oleh PCR

Objektif kaedah genetik molekul untuk kerentanan dadah atau rintangan Mycobacterium tuberculosis mengurangkan untuk mengenalpasti mutasi dalam urutan nukleotida tertentu gen yang diketahui. Kaedah asas adalah berdasarkan sama ada di prochityvanii langsung (sequencing) urutan ini selepas penguatan atau penghibridan serpihan DNA biotin dilabelkan dikuatkan semasa kuar PCR DNA. Kedua-dua alternatif melibatkan mengenal pasti penggantian nukleotida dalam urutan yang menggunakan probe DNA membawa kepada ketiadaan atau penghibridan yang tidak lengkap untuk membran nitrocellulose menggunakan konjugat enzim (streptavidin-alkali phosphatase) - Kaedah LIPA-Rif-TB.

Kaedah untuk mengukur pendarfluor dalam tempatan ditetapkan pada microsections DNA kuar pelengkap kepada mutasi dikenali di kawasan gen PCR dikuatkan bertanggungjawab untuk rintangan atau sensitiviti dadah, dipanggil mikrobiochipov kaedah. Algoritma utama untuk menjalankan penyelidikan ini adalah seperti berikut. Selepas mengasingkan DNA daripada sampel klinikal atau budaya mycobacteria adalah perlu untuk menjalankan PCR penguatan serpihan berkaitan gen rpoB bertanggungjawab sensitiviti dadah untuk rifampicin atau katG dan Inha gen pengekodan protein Mycobacterium bertanggungjawab untuk kepekaan terhadap Isoniazid. Hasil PCR dinilai oleh elektroforesis gel agarose, di mana serpihan DNA yang sepadan dengan panjang yang diingini disahkan. Kemudian, pusingan kedua PCR dilakukan untuk memperkenalkan label neon ke dalam DNA. Hasil PCR sekali lagi disahkan oleh elektroforesis gel. Selepas itu, penghibridan telah dijalankan (pengeraman semalaman), diikuti dengan membasuh bahan yang terhasil pada biochip, yang sebilangan besar tetap di dalam satu bekas kaca kecil helai DNA ringkas (probe) yang merupakan pelengkap kepada nukleotida urutan jenis Mycobacterium tuberculosis dadah sensitif di pintu mutasi mungkin. Serta kepada urutan mutan yang bertanggungjawab terhadap rintangan dadah. Lokasi probe DNA dalam pinggan - ketat ditakrifkan, dan tahap pendarfluor diperhatikan apabila penghibridan untuk menentukan hasilnya menggunakan peranti membaca khas dipasang. Dalam hal ini, keputusan analisa ditentukan melalui program komputer khas.

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, kaedah alternatif untuk menentukan sensitiviti dadah tuberkulosis mycobacteria berasaskan teknologi PCR masa nyata telah dibangunkan, yang memungkinkan untuk menjalankan kajian ini dalam ujian tiub tertutup.

Dalam Rajah. 13-13 mempersembahkan hasil analisis klinik klinik mycobacterium tuberculosis dalam penentuan ketahanan dadah terhadap rifampicin oleh PCR masa sebenar: 218 - sampel kawalan (sensitif terhadap rifampisin); 93 - kawalan positif bagi mutasi Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162-322 - sampel eksperimen. Hasil perhitungan keluk kinetik amplifikasi pada 4 saluran: saluran 1: 393 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Trp TCG-TGG; saluran 2: 4482 - kawalan positif untuk mutasi Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - sampel percubaan; saluran 4: keluk kinetik penguatan semua sampel yang menyertai eksperimen. Kawalan positif tindakbalas penguatan. Kesimpulan: Berdasarkan hasil analisis, mutasi berikut yang menentukan rintangan terhadap rifampicin telah dikenal pasti: dalam sampel 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. Prinsip yang sama digunakan untuk menentukan ketahanan dadah pada isoniazid untuk gen katG dan inhA, yang menentukan mutasi yang paling kerap.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Pengenalan strain mycobacterium tuberculosis

Kaedah yang paling teliti dikaji pengenalan strain Mycobacterium tuberculosis adalah teknik dipanggil sekatan panjang serpihan polymorphism (RFLP RFLP. Atau dalam versi Bahasa Inggeris) dan yang berasaskan fragmentirovanin (sekatan) enzim Mycobacterium tuberculosis DNA PVU II dan serpihan diperolehi penghibridan berikutnya dengan urutan khusus tertentu pada DNA elemen berulangnya IS6110. Variabiliti intraspecifik direalisasikan kerana bilangan ulangan IS6110 yang berlainan dan lokasi mereka pada DNA. Serta pelbagai jarak antara titik serangan enzim tertentu enzim (tapak sekatan) dan elemen IS6110. Teknologi ini sangat rumit dan memakan masa. Selepas rawatan dengan DNA diekstrak daripada budaya Mycobacterium tuberculosis, gel elektroforesis dilakukan dengan enzim sekatan, dan kemudian dipindahkan serpihan DNA panjang yang berbeza pada membran nitrocellulose, penghibridan telah dijalankan dengan serpihan IS6110-elemen dan dikesan melalui tindak balas enzim. Corak khas band yang dihasilkan mencirikan DNA dari ketegangan tertentu Mycobacterium tuberculosis. Dengan bantuan analisis komputer, identiti atau keterkaitan strain diturunkan. Walaupun kaedah RFLP adalah yang paling diskriminatif, iaitu mendedahkan bilangan terbesar perbezaan dalam strain dianalisis, ia tidak berkesan dengan bilangan kecil (kurang daripada 5) ulangan IS6110 yang diperhatikan dalam beberapa strain. Dalam Rajah. 13-14 menunjukkan hasil RFLP menaip strain.

Alternatif mungkin merupakan kaedah spoligotip - analisis polimorfisme urutan spacer DNA - pertengahan antara pengulangan terus di rantau DR. Apabila menjalankan spoligotiping strain, PCR dilakukan dengan primer yang merangkumi rantau DR, selepas mana serpihan panjang yang berbeza terbentuk yang menghiburkan dengan kawasan perantaraan yang berubah-ubah DNA. Analisis urutan spacer rantau DR dibentangkan. Menurut penyelidik, lebih mudah, produktif dan sesuai untuk pemeriksaan utama strain dan analisis epidemiologi awal, serta penyelidikan langsung bahan klinikal.

Jelas sekali, kaedah yang lebih berkesan dan teknologi yang boleh diakses adalah VNTR (singkatan perkataan bahasa Inggeris), atau kaedah menentukan bilangan pemboleh ubah yang sama diulangi dalam DNA mycobacterium tuberculosis. Kaedah ini hanya berdasarkan penggunaan PCR dan tidak memerlukan manipulasi tambahan. Oleh kerana bilangan tandem berulang dalam strain yang berlainan dan di lokus yang berbeza adalah berbeza, serpihan saiz yang berbeza ditentukan dan dianalisis pada elektroforegram produk PCR yang terhasil. Menurut penyelidik, menggunakan VNTR mencapai tahap diskriminasi strain yang lebih besar daripada dengan kaedah RFLP.

Banyak perhatian telah dibayar pada tahun-tahun kebelakangan ini untuk pengedaran strain Mycobacterium tuberculosis keluarga W-Beijing (kadang-kadang dipanggil ketegangan Beijing), yang sebahagian besarnya tahan dadah.

Keperluan asas kepada kualiti penyelidikan biologi molekul

[72], [73], [74], [75],

Dokumen peraturan asas untuk PCR

Pesanan Kementerian Rusia Kesihatan: №45 dari 2000/07/02 g .. Nombor 109 daripada 2003/03/21 g .. Nombor 64 daripada 2000/02/21, Garis Panduan: 1.3.1888-04 "Pertubuhan kerja dalam kajian menggunakan bahan PCR dijangkiti patogen biologi ejen kumpulan III-IV patogenisiti "; 1.3.1794-03 "Pertubuhan kerja dalam kajian bahan PCR, dijangkiti mikroorganisma kumpulan patogenik I-II". 2003; 3.5.5.1034-01 "dekontaminasi bahan, dijangkiti bakteria I-IV kumpulan pathogenicity apabila menggunakan PCR," 2001 Lampiran 11 kepada arahan yang bersatu untuk kaedah pemeriksaan mikrobiologi dalam mengenal pasti, diagnosis dan rawatan batuk kering.

[76], [77], [78]

Kakitangannya

Pelaksanaan penyelidikan biologi molekul boleh memegang doktor diagnostik klinikal makmal, doktor bacteriologists, virologi, doktor, ahli biologi, makmal diagnostik klinikal, serta pakar dengan pendidikan perubatan menengah, yang diluluskan pengkhususan dan latihan lanjutan dalam cara yang ditetapkan.

Pengaturan premis makmal

Bilik-bilik makmal berikut diperlukan:

• Kawasan pengendalian sampel adalah makmal yang disesuaikan untuk bekerja dengan agen-agen berjangkit kumpulan patogenik III-IV, mengikut Arahan Mekanikal 13.1888-04.
• Zon untuk penyediaan campuran tindak balas PCR - bilik makmal, yang memberikan perlindungan daripada pencemaran makmal dalaman - zon "bersih".
• • Jika elektroforesis atau hibridisasi digunakan untuk menganalisis produk PCR. Bilik makmal di mana serpihan DNA berganda diekstrak daripada tiub dan penguatan, masing-masing, boleh masuk ke dalam alam sekitar, selaras dengan keperluan untuk makmal-makmal PCR (1.3.1794-03 Garis Panduan, Panduan 1.3.1888-04) mestilah sepenuhnya adalah terpencil dari premis yang dinyatakan dalam perenggan sebelumnya. Ia harus dikecualikan daripada zon pergerakan ke zon elektroforesis untuk pengendalian sampel dan "bersih" kawasan mana-mana kakitangan, peralatan, bahan-bahan dan objek, serta pemindahan udara melalui sistem pengudaraan, atau akibat daripada draf. Zon ini tidak diperlukan untuk pengesanan fluorimetrik produk PCR.
• Bilik untuk dokumentasi dan pemprosesan keputusan dilengkapi dengan komputer dan peralatan pejabat yang diperlukan. Bilik ini mungkin mengandungi peralatan yang menyediakan pengesanan produk PCR tanpa membuka tiub. - Pengesan PCR fluorescent dan cycler haba untuk PCR masa nyata.

Keperluan kebersihan dan epidemiologi untuk rawatan utama sputum adalah serupa dengan keperluan mikrobiologi piawai untuk bekerja dengan tuberkulosis mycobacteria.

[79], [80], [81], [82],

Penyiapan kelengkapan makmal untuk diagnostik PCR

Makmal ini termasuk peralatan untuk bilik-bilik berikut.

• bilik untuk penyediaan sampel, mengandungi peralatan berikut: laminar kelas II perlindungan "SP-1.2": termostat keadaan pepejal dengan penutup pemanas untuk tiub ujian "Eppendorf" jenis; microcentrifuge pada 13,000 rpm; centrifuge (Vortex); peti sejuk dengan julat suhu dari ^-20о С hingga +10 ^о С; pipet volum yang berubah-ubah dalam siri "Rroline"; sebuah pam dengan kelalang perangkap OM-1; tripod untuk pipet; stesen kerja tripod 200x0.5 ml; stesen kerja tripod 50x1.5 ml; Duduk untuk menyimpan tiub ujian 80x1.5 ml;
• Ruang penyediaan campuran reaksi: ruang perlindungan PCR-box ("Laminar-C. 110 cm); centrifuge - Vortex; Pipih volum yang berbeza dari siri Proline; tripod untuk pipet; stesen kerja tripod 200x0.2 ml; Duduk untuk menyimpan tiub ujian 80x1.5 ml; peti sejuk dengan pelbagai suhu dari -20 ^ke C untuk + 10 ^daripada C;
• ruang untuk elektroforesis: kamera untuk elektroforesis mendatar; bekalan kuasa; transilluminator;
• Penguat DNA atau penganalisis asid nukleik (PCR dalam masa nyata) dengan komputer dan perisian; boleh ditempatkan di mana-mana ruang ganti. Jika teknologi PCR masa nyata digunakan. Ruang untuk elektroforesis tidak diperlukan.

[83], [84], [85], [86]

Kawalan kualiti luaran

Untuk yakin untuk mendapatkan hasil yang boleh dipercayai secara objektif, makmal harus mengambil bahagian dalam sistem penilaian luaran kualiti penyelidikan makmal.

Peserta dalam sistem kawalan kualiti menerima; 12 ampul dengan penggantungan lyophilized sel bakteria, yang mengandungi E. Coli E. Coli, 3 ampul dengan mycobacterium tuberculosis (strain avirulent) pada kepekatan 10 ² / ml; 3 ampul dengan sel-sel strain yang sama dalam kepekatan 10 ⁴ / ml; 2 ampul dengan mycobacteria non-tuberculosis M. Avium-intracellulare dan M. Kansasii dalam kepekatan 10 ⁵ / ml.

Ujian yang diagihkan untuk penilaian kualiti luaran adalah pra-uji di dua makmal bebas dengan pengalaman yang luas dalam bidang ini.

[87], [88]