Model eksperimen osteoarthritis

Rawan adalah tisu yang sangat khusus yang mengandungi hanya satu jenis sel (chondrocytes), yang dicirikan oleh ketiadaan salur darah dan limfa. Pemakanan rawan terutamanya dilakukan oleh penyerapan dari cecair sinovial. Metabolisme chondro-cytes dikawal oleh beberapa faktor larut yang dihasilkan secara tempatan oleh chondrocytes dan tisu sekitarnya. Fungsi chondrocytes juga bergantung kepada komposisi medium ekstraselular (ketegangan oksigen, kepekatan ion, pH, dll), komposisi VCM, interaksi sel dan matriks, isyarat fizikal. Tugas utama pemodelan eksperimen adalah penciptaan budaya dalam persekitaran ekstraselular tanpa mengubah fenotip sel dewasa. Tugas kedua adalah untuk mewujudkan budaya untuk mengkaji tindak balas chondrocytes pramatang, lambat, pendek atau jangka panjang kepada isyarat kimia dan / atau fizikal. Kajian in vitro juga memberi peluang untuk mengkaji tingkah laku kondrosit dalam osteoarthritis. Tugas ketiga ialah pembangunan sistem kooperatif, yang membolehkan mempelajari interaksi pelbagai tisu di sendi. Tugas keempat adalah penyediaan implan cartilaginous untuk transplantasi berikutnya. Dan akhirnya, tugas kelima adalah mengkaji faktor pertumbuhan, sitokin atau agen terapeutik yang mampu merangsang pembaikan dan / atau menghalang resorpsi rawannya.

Sepanjang dekad yang lalu, pelbagai model budaya sel rawan artikular telah diwujudkan, termasuk budaya monolayer, budaya yang digantung, budaya chondron, eksplan, kultur, budaya sel immortal. Setiap budaya mempunyai kelebihan dan kekurangannya dan masing-masing sesuai untuk mengkaji satu aspek tertentu metabolisme chondrocyte. Oleh itu, explant cartilaginous adalah model yang sangat baik untuk mengkaji perolehan unsur-unsur matriks, yang memerlukan reseptor permukaan sel tulen dan sel-matriks biasa dan interaksi sel-matriks. Pada masa yang sama, kajian deposit dalam matriks atau mekanisme untuk pengawalan metabolisme chondrocyte dianjurkan untuk dijalankan pada budaya sel terpencil. Budaya ketumpatan rendah monolayer diperlukan untuk mengkaji proses pembezaan sel. Budaya yang digantung dalam matriks semulajadi atau sintetik adalah satu model untuk menganalisis tindak balas penyesuaian chondrocytes kepada tekanan mekanikal.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Budaya Chondrocyte

Apabila memilih tisu rawan untuk kajian in vitro, beberapa perkara penting perlu dipertimbangkan. Komposisi matriks dan aktiviti metabolik daripada kondroit bervariasi dalam sendi yang berbeza, dan yang kedua juga bergantung kepada kedalaman kondroit dalam tisu. Data-data ini diperolehi dalam beberapa eksperimen di mana subpopulasi terpencil chondrocytes dari zon tulang rawan kedalaman yang berbeza telah dipelajari. Sejumlah perbezaan morfologi dan biokimia didapati di antara kondroit yang ditanam di permukaan dan lapisan dalam rawan artikular. Sel-sel permukaan mensintesis matriks fibrillar proteoglycan yang jarang, habis, manakala sel-sel yang lebih dalam menghasilkan matriks yang kaya dengan fibrils dan proteoglycans. Selain itu, sel-sel permukaan menghasilkan proteoglycans yang tidak teragregat dan asid hyaluronik yang agak kecil dan aggrecan dan keratan sulfat yang agak kurang daripada chondrocytes yang lebih mendalam. Satu lagi ciri penting yang membezakan metabolisme chondrocytes yang diasingkan dari zon rawan kedalaman yang berbeza adalah tindak balas terhadap rangsangan eksogen. Menurut M. Aydelotte dan co-authors, chondrocytes lembu dari zon permukaan rawan lebih sensitif terhadap IL-1 daripada sel-sel zon dalam.

Tingkah laku sel juga bergantung kepada lokasi tisu. Kondrosit rawan dan telinga tepi, yang diambil dari haiwan yang sama yang bertindak balas secara berbeza kepada faktor pertumbuhan seperti faktor pertumbuhan fibroblast (FGF), dan TGF-beta. FGF meningkat diperbadankan thymidine, proline dan leucine kepada budaya kondrosit tulang rusuk tetapi tidak telinga. TGF-P meningkat pemerbadanan thymidine ke kondrosit rawan tulang rusuk dan telinga, tetapi tiada kesan pada thymidine penggabungan ke kondrosit dan telinga proline. Sel-sel rawan yang diperolehi daripada zon yang mempunyai beban yang paling besar adalah berbeza daripada mereka dari tapak dengan beban yang rendah pada tulang rawan. Sebagai contoh, kondrosit matang daripada tulang rawan sendi lutut dari wilayah tengah domba artikular permukaan tibial tulang tidak dilindungi oleh meniskus yang membawa beban yang paling besar dalam vivo, aggrecan disintesis lebih kecil, decorin tetapi lebih besar daripada sel-sel kawasan yang diliputi oleh meniskus. Pengarang juga menekankan kepentingan menggunakan rawan sendi kawasan yang sama dalam kajian fungsi sintetik sendi.

Metabolisme chondrocytes dan tindak balas mereka terhadap faktor pengawalseliaan juga bergantung kepada umur penderma, perkembangan kerangka dan keadaan sendi dari mana sel-sel itu diambil. Dalam kondroit manusia, penurunan ketara dengan umur tindak balas proliferatif diperhatikan. Penurunan terbesar diperhatikan dalam penderma berusia 40-50 tahun dan lebih dari 60 tahun. Selain itu, keterukan tindak balas proliferatif terhadap faktor pertumbuhan (contohnya, FGF dan TGF-beta) menurun semasa penuaan. Sebagai tambahan kepada perubahan kuantitatif dalam perkembangan kondroit, terdapat juga perubahan kualitatif. Sel donor muda (10-20 tahun) bertindak balas dengan lebih baik kepada faktor pertumbuhan platelet yang diperolehi daripada PDGF berbanding dengan TGF-beta, sedangkan yang bertentangan diperhatikan dalam sel penderma dewasa. Untuk menerangkan perubahan-perubahan yang bergantung pada umur dalam fungsi sintetik chondrocytes dan tindak balas mereka terhadap kesan faktor pertumbuhan, beberapa mekanisme digunakan. Antaranya, pengurangan bilangan dan pertalian reseptor selular permukaan, perubahan dalam sintesis dan bioaktiviti faktor pertumbuhan dan sitokin, dan pengubahsuaian isyarat postepeptor.

Keadaan patologi sendi juga mengubah morfologi dan aktiviti metabolik kondroit. Jadi, J. Kouri dan penulis bersama (1996) mengenal pasti tiga subpopulasi kondroit dalam rawan dengan osteoarthritis. Chondrocytes dari bahagian dangkal dan bahagian atas kelompok bentuk tulang rawan dan mensintesis lebih banyak proteoglycans dan kolagen. TGF-beta, dan faktor pertumbuhan seperti insulin (IGF) boleh merangsang sintesis proteoglikan oleh kondrosit dan sebahagiannya meneutralkan kesan-kesan IL-1 dan TNF-a. Eksplant rawan penderita Osteoartritis dan kondrosit-kondrosit diasingkan daripada tulang rawan pesakit dengan osteoartritis, adalah lebih sensitif kepada rangsangan TGF-beta daripada kondrosit rawan yang sihat. Perbezaan ini kemungkinan besar dikaitkan dengan perubahan fenotip dalam kondroit dalam lapisan atas rawan artikular.

Pengasingan individu kondroitus dicapai dengan rawatan berurutan dengan enzim proteolitik ECM. Selepas pembebasan mereka dari ECM, sel terpencil sesuai untuk mengkaji sintesis komponen matriks de novo. Sesetengah penulis hanya menggunakan clostridium collagenase, yang lain rawan pra-inkubasi dengan trypsin, pronase, DNase dan / atau hyaluronidase. Bilangan sel terpencil bergantung kepada enzim yang digunakan. Oleh itu, apabila memproses satu tisu collagenase 1 g boleh diperolehi 1,4T0 ⁶ kondrosit, sedangkan apabila menggunakan pronase, hyaluronidase dan collagenase - 4,3-10 ⁶. Apabila pemprosesan dengan kolagenase, aggrecan, protein, IL-6, IL-8 kekal dalam budaya sel lebih daripada sekadar rawatan berjujukan dengan pelbagai enzim. Terdapat beberapa penjelasan untuk perbezaan ini antara dua budaya sel:

• reseptor sel rosak atau tertekan oleh tindakan enzim, TGF-beta menghalang sintesis DNA proteoglikan dalam kondrosit yang baru diasingkan (hari 1), manakala DNA dan sintesis proteoglikan kondrosit berbudaya dalam monolayer (7 hari) dirangsang oleh TGF-beta. Walau bagaimanapun, ungkapan semula komponen membran memerlukan tempoh yang mencukupi sebelum memulakan eksperimen.
• Protease eksogen boleh memecahkan interaksi sel dan matriks, yang disejajarkan oleh integrit. Keluarga integrin mempromosikan lampiran chondrocytes ke molekul VKM (Shakibaei M. Et al, 1997). Pecahan ini boleh menjejaskan ungkapan gen matriks.
• Residu komponen matriks boleh mengawal fungsi sintetik chondrocytes. Integrins dapat mengenalpasti produk degradasi ECM, dengan itu memainkan peranan penting dalam pembaikan tisu selepas terdedah kepada enzim proteolitik. T. Larsson et al (1989) melaporkan bahawa penambahan proteoglikan utuh atau berpecah-belah dalam sel-sel berbudaya merangsang sintesis protein dan proteoglikan. Walau bagaimanapun, tahap asid hyaluronik menyebabkan pengurangan ketara dalam kemasukan sintesis proteoglikan sulfat oleh kondrosit kondrosit embrio ayam matang sel babi dan tikus chondrosarcoma. Selain itu, asid hyaluronik - perencat pelepasan proteoglikan dari sel-sel walaupun di hadapan IL-lb, TNF-a, FGF, menunjukkan bahawa yang pertama mengimbangi aktiviti biologi faktor pertumbuhan dan sitokin. Mekanisme yang tepat yang mendasari tindakan asid hyaluronik masih tidak jelas; Telah diketahui bahawa kondroit mempunyai reseptor untuk asid hyaluronik, yang dikaitkan dengan filamen aktin sitosol. Pengikatan asid hyaluronik kepada reseptornya merangsang fosforilasi protein. Oleh itu, data ini menunjukkan fungsi metabolik modulasi kondrosit asli atau berpecah-belah protein molekul matriks dengan mengaktifkan reseptor membran sel.
• Rangsangan pesat oleh enzim sintesis protein matriks oleh chondrocytes boleh menjadi akibat perubahan dalam bentuk chondrocytes dan / atau penyusunan semula sitoskeleton.
• Sesetengah sitokin (contohnya, IL-8) dan faktor pertumbuhan (contohnya, IGF-1, TGF-P) ditetapkan dalam ECM. Contoh yang paling terkenal adalah pengikatan TGF-beta dengan decore, yang menyebabkan penurunan keupayaan yang terdahulu untuk mendorong pertumbuhan sel sel induk dalam hamster Cina. Data yang kandungan hiasan rawan meningkat dengan usia, menunjukkan pengurangan bioavailabiliti TGF-beta dalam penuaan. Faktor pertumbuhan dan sitokin boleh dilepaskan dari residu matriks semasa kultur dan kemudian memodulasi fungsi chondrocyte.

[8], [9], [10], [11],

Kultur monolayer chondrocytes

Fenotip kromosom yang dibezakan terutamanya dicirikan oleh sintesis kolagen jenis II dan proteoglisans khusus tisu, serta tahap aktiviti mitosis yang rendah. Terdapat bukti bahawa penanaman jangka panjang sel dalam monolayer, dan selepas beberapa petikan berulang sel, kondrosit kehilangan bentuk sfera mereka, menjadi memanjang, fibroblast seperti bentuk. Dengan fungsi sintetik fibroblast metaplasia itu juga diubahsuai sel, ciri-ciri penurunan progresif dalam sintesis kolagen II, IX dan jenis XI dan sintesis baik daripada kolagen I, III dan Utipov. Proteoglycans tidak terkumpul kecil disintesis oleh aggrecan fungsional. Synthetzatepsin B dan L sangat rendah dalam sel-sel dibezakan, tetapi dalam proses kehilangan peningkatan pembezaan. Collagenase-1 dinyatakan dalam kondroit yang berbeza, dengan penanaman yang berpanjangan, ekspresinya menurun, sementara penghasilan penghambat tisu metalikoprotease (TIMP) meningkat.

The chondrocytes yang dibezakan semula mengekspresikan kolagen dari fenotip yang dibezakan apabila ia dipindahkan dari budaya monolayer kepada yang digantung. Proses pembezaan mungkin berkaitan dengan bentuk sel. Harta ini digunakan secara kerap oleh penyelidik yang mempelajari transplantasi yang cacat dengan chondrocytes autologous. Sebilangan kecil sel yang diperoleh daripada bahan biopsi boleh didarabkan dalam budaya monolayer dan kemudian diletakkan semula dalam matriks tiga dimensi sebelum pemindahan. Re-ungkapan phenotype tertentu kondrosit dedifferentiated berhijrah dalam budaya agarose, boleh dirangsang oleh TGF-p-ossein hydroxyapatite kompleks dan askorbik asid.

Sebagai tindak balas kepada kesan faktor pertumbuhan dan sitokin, chondrocytes diubahsuai semasa proses pembezaan. Respons selular kepada cytokines dan faktor pertumbuhan berbeza antara chondrocytes yang tidak dibezakan dan dibezakan. IL-1 merangsang percambahan fibroblas, sementara pertumbuhan kondroit yang tidak dapat dibedakan dihalang oleh IL-1. Sintesis DNA dirangsang oleh IGF-1 dalam pemanjangan, tetapi tidak terkandung kondroit. Dalam kondroit yang membezakan, kesan stimulasi IL-1β dan TNF-α pada produk procollagenase lebih ketara daripada yang tidak dibezakan.

Penanaman chondrocytes

Penanaman chondrocytes dalam penggantungan dalam medium cecair atau dalam matriks tiga dimensi semulajadi atau sintetik menstabilkan fenotip daripada chondrocyte. Sel mengekalkan bentuk sfera mereka, mensintesis protein khusus tisu. Satu budaya chondrocyte berwajaran biasanya disyorkan untuk mengkaji pembentukan matriks periselular baru. Kebudayaan Chondrocyte dalam polimer penyerap sintetik atau semulajadi digunakan untuk menanam sel-sel ke dalam kecacatan tulang rawan untuk merangsang pertumbuhan semula tisu rawan sendi. Persekitaran sintetik atau semulajadi untuk sel implan mesti memenuhi beberapa keperluan:

• Implant harus mempunyai struktur poros untuk pertumbuhan lekatan dan sel,
• sama ada polimer itu sendiri mahupun produk degradasinya akan menyebabkan keradangan atau tindak balas toksik semasa implan vivo,
• pembawa pemindahan harus dapat mengikat tulang rawan atau subchondral yang bersebelahan,
• matriks semulajadi atau sintetik mesti mampu menyerap, kemerosotannya mesti seimbang dengan regenerasi tisu,
• Untuk memudahkan pembaikan tulang rawan, struktur kimia dan seni bina matriks matriks harus membantu mengekalkan fenotip sel yang dikodkan oleh kondroit dan sintesis protein khusus tisu,
• semasa implan di vivo, adalah perlu untuk mengkaji sifat-sifat mekanik matriks sintetik atau semulajadi.

[12], [13], [14], [15], [16]

Penggantungan kondroit dalam fasa cecair

Lampiran sel kepada kapal plastik, di mana pengkulturan kondrosit boleh dicegah dinding mereka disalut dengan selulosa penyelesaian methyl, agarose, hidrogel (poly-2-hydroxyethylmethacrylate) atau campuran kolagen-agarose. Di bawah keadaan ini, chondrocytes membentuk kelompok dan mensintesis terutamanya aggrecan dan collagen-tisu khusus (II, IX, XI). Selalunya, dua jenis sel dijumpai. Sel-sel yang terletak di tengah mengekalkan bentuk sfera yang dikelilingi oleh ECM yang dibangunkan dengan baik, yang disahkan oleh kajian histokimia dan ultrastruktur. Pada chondrocytes pinggir mempunyai kontur diskoid, dikelilingi oleh ECM yang jarang berlaku; Sedikit diketahui tentang ciri-ciri fungsian sel tersebut.

Penanaman chondrocytes pada microcarriers disokong dalam penggantungan adalah mungkin; Manik Dextran (cytodex), manik dextran bersalut kolagen (cytodex III), mikrosfera bukan koloid dari kolagen jenis I (kolagen) digunakan sebagai microcarriers. Di bawah keadaan kultur ini, chondrocytes melekat pada permukaan microcarrier, mengekalkan bentuk sfera mereka, dan menghasilkan bahan seperti matriks. Lebih-lebih lagi, penggunaan kolagen menggalakkan perkembangan kromosomit dan penekanan semula fenotip biasa. Oleh itu, penanaman chondrocytes pada mikrosfera kolagen boleh digunakan untuk memulihkan fenotip sel sebelum pemindahan.

Kaedah lain penanaman penggantungan kondroit dalam medium cecair adalah penanaman mereka dalam bentuk padat yang terdiri daripada sel (0.5-1 * 10 ^b ) yang diperolehi oleh sentrifugasi. Chondrocytes tersebut dapat menghasilkan matriks yang mengandungi sejumlah besar proteoglycans, jenis kolagen II, tetapi bukan jenis kolagen, yang disahkan oleh kaedah histologi, imunohistokimia dan kuantitatif.

Penggantungan kondroit dalam ECM semulajadi

Chondrocytes boleh dibiakkan dalam penggantungan dalam matriks tiga dimensi (agar lembut, agarose, gel kolagen atau span, asid hyaluronik, gam fibrin, manik alginat).

Chondrocytes agarosa yang ditanam mengekalkan fenotip normal mereka dan mensintesis jenis kolagen II dan agregat agregat-tisu khusus tisu. Apabila berbudaya dalam agarose, proteoglikan sel-sintesis dilepaskan ke dalam medium selama 50 hari. Sebagai perbandingan - dalam budaya monolayer, fasa sel telah dipenuhi dengan glycosaminoglycans yang telah dilakukan dalam penanaman 5-6 hari pertama; apabila ditanam dalam medium selepas sintesis dan pelepasan glycosaminoglycans dipergiatkan, pengurangan masa dalam glikosaminoglycans berlaku dalam 8-10 hari pertama. Walau bagaimanapun, kelakuan kondroit dalam penanaman mereka dalam agarose berbeza dari keadaan dalam vivo. Dalam agarose, sebilangan agregat Aggregan yang disintesis mengandungi molekul yang lebih kecil dan lebih kecil daripada dalam vivo. TGF-P merangsang sintesis proteoglycans dalam menerangkan, tetapi mengurangkan sintesis aggrecan dalam agarose.

Alginate adalah polysaccharide linear yang berasal dari rumpai laut coklat. Di hadapan kation divalen, seperti Ca ^{2+ ion}, polimer ini menjadi gel. Setiap kondrosit terperangkap dalam alginate, dikelilingi oleh matriks polisakarida bercas negatif, liang-liang yang boleh dibandingkan dengan orang-orang hening rawan. Matriks yang terbentuk kondrosit dalam manik alginate, yang terdiri daripada dua segmen - lapisan nipis matriks sel-berkaitan yang sepadan dengan matriks pericellular dan wilayah rawan artikular dan lebih matriks jauh bersamaan interterritorial dalam tisu asli. Pada hari ke-30 budaya, jumlah relatif dan mutlak diduduki oleh sel-sel, dan setiap daripada kedua-dua jabatan di manik alginate adalah hampir sama dengan yang rawan asli. Selama hampir 30 hari kondrosit mengekalkan bentuk sfera dan menghasilkan aggrecan, sifat hidrodinamik yang sama dengan molekul aggrecan dalam matriks artikular rawan dan kolagen molekul II, IX dan XI jenis. Pada masa yang sama, seperti budaya lain, penggantungan, manik alginate pada permukaan sel-sel leper hadir yang menjana sejumlah kecil jenis I kolagen molekul, yang dikeluarkan terus ke dalam alam sekitar dan tidak dimasukkan dalam VCR. Dalam manik alginate, perkembangan sederhana chondrocytes diperhatikan. Selepas 8 bulan penanaman dalam gel alginate kondrosit matang tidak kehilangan aktiviti metabolik dan terus mensintesis tisu khusus kolagen jenis II dan aggrecan.

N. Tanaka dan coauthors (1984) menyiasat sifat penyebaran pelbagai molekul semula jadi dalam alginat dan mendapati bahawa molekul lebih besar daripada 70 kD tidak meresap melalui alginat. Oleh itu, penanaman sel dalam alginat sesuai untuk mengkaji peraturan biosintesis matriks dan organisasi ECM. Ketersediaan sel yang ditanam dalam alginat membolehkan seseorang untuk mengkaji kesan faktor pengawalseliaan peptida dan agen farmakologi pada tahap transkrip, posttranskriptik dan translasi.

Chondrocytes juga berbudaya dalam matriks jenis gentian kolagen I dan II. S. Nehrer et al (1997) berbanding operasi dalam anjing kondrosit proteoglikan selain matriks Collagen-polimer yang mengandungi kolagen jenis yang berbeza. Mereka mendapati perbezaan penting dalam morfologi fungsi biosynthetic chondrocytes yang dibiakkan dalam matriks kolagen yang mengandungi jenis kolagen I dan II. Sel-sel dalam matriks jenis kolagen II menggulung bentuk sfera mereka, manakala dalam jenis I kolagen, mereka mempunyai morfologi seperti fibroblast. Lebih-lebih lagi, dalam matriks kolagen jenis II, kondrotiit menghasilkan lebih banyak glikosaminoglikas. J. Van Susante et al (1995) membandingkan sifat-sifat kondroit yang dibiakkan dalam alginat dan kolagen (jenis I) gel. Penulis mendapati peningkatan yang ketara dalam bilangan sel-sel dalam gel kolagen, tetapi hari ke-6 penanaman, sel-sel hilang phenotype ciri-ciri mereka, bertukar menjadi sel-sel fibroblast-suka. Dalam gel alginate, penurunan dalam bilangan sel telah diperhatikan, tetapi kondrofiit mengekalkan fenotip normal mereka. Jumlah kolagen gel proteoglikan setiap sel adalah lebih tinggi daripada di alginate, tetapi penurunan diperhatikan dalam sintesis unsur gel matriks bermula dari hari ke-6 penanaman, sedangkan dalam sintesis alginate terus berkembang.

Matriks fibrin tiga dimensi pepejal adalah bahan semulajadi yang menyokong chondrocytes ditimbang di dalam fenotip yang berbeza. Matriks fibrin 3D juga boleh digunakan sebagai pembawa untuk transplantasi chondrocyte. Kelebihan fibrin adalah ketiadaan sitotoksisiti, keupayaan untuk mengisi ruang, keupayaan pelekat. Oleh kajian histologi dan biokimia Autoren-diografii, elektron mikroskop mendedahkan bahawa kondrosit dalam gel fibrin mengekalkan morfologi mereka, membiak dan menghasilkan matriks walaupun selepas 2 minggu penanaman. Walau bagaimanapun, G. Homminga et al (1993) melaporkan bahawa selepas 3 hari budaya, bermula perpecahan fibrin berlangsung dedifferentiation kondrosit.

Penggantungan kondroit dalam ECM buatan (sintetik)

Implan rawan untuk pembedahan rekonstruktif atau ortopedik boleh diperolehi dengan meningkatkan kondroit yang terpencil secara in vitro dalam matriks biokompativ sintetik.

Kultur asid polyglycolic yang dibiakkan membiak dan mengekalkan morfologi dan fenotip biasa dalam masa 8 minggu. Kompleks asid chondrocyte-polyglycolic terdiri daripada sel, glycosaminoglycans, collagens, dan mempunyai kapsul kolagen luar. Walau bagaimanapun, dalam implan sedemikian terdapat dua jenis molekul kolagen - I dan II. Implan dari dedifferentiated oleh siri saluran kondroit mempunyai lebih banyak glikosaminoglikans dan collagens daripada implan daripada chondrocytes yang tidak dapat dibezakan.

L. Freed et al (1 993b) berbanding tingkah laku budaya kondrosit manusia dan bovine dalam asid polyglycolic berserabut (EQAP) dan dalam asid perpecahan polilaktilovoy (PPLC). Selepas 6-8 minggu penanaman chondrocytes lembu dalam HSVG atau PPLC, penulis mendapati pertumbuhan semula sel dan regenerasi matriks rawan. Di HSBC, chondrocytes adalah sfera, terletak di lacunae yang dikelilingi oleh matriks kartilaginous. Setelah 8 minggu dalam budaya in vitro, tisu regenerasi mengandungi 50% bahan kering (4% jisim sel, 15% glikosaminoglikans, dan 31% kolagen). Di dalam sel-sel PPLK terdapat spindle berbentuk, sedikit glikosaminoglikans dan kolagen. Di HSBC, pertumbuhan sel adalah 2 kali lebih sengit daripada PTCA. Dalam keadaan vivo, chondrocytes yang ditanam di HPVC dan PPLC selama 1 hingga 6 bulan menghasilkan tisu secara histologi yang sama dengan tulang rawan. Implan mengandungi glikosaminoglikas, jenis I dan jenis collagens II.

Chondrocytes jantan janin dibiakkan dalam poliamilena hidrofobik dan hidrofilik ketumpatan tinggi poros. Selepas 7 hari inkubasi di kedua-dua substrat, sel-sel tersebut mengekalkan bentuk sfera, terutamanya mengandungi kolagen jenis II. Selepas 21 hari penanaman, ternyata matriks hidrofilik mengandungi lebih banyak jenis kolagen daripada matriks hidrofobik.

Tisu rawan juga boleh didapati dengan membiak dalam monolayer pada penapis Millicell-CM. Pra-salutan penapis dengan kolagen diperlukan untuk lampiran chondroits. Pemeriksaan histologi kebudayaan menunjukkan pengumpulan kondroit dalam ECM yang mengandung proteoglikan dan kolagen jenis II. Jenis kolagen I dalam budaya semacam itu tidak dikesan. Chondrocytes dalam tisu cartilaginous yang dihasilkan mempunyai bentuk sfera, tetapi pada permukaan tisu mereka agak diratakan. Ketebalan tisu yang baru terbentuk bertambah dengan masa dan bergantung kepada kepadatan awal sel monolayer. Di bawah keadaan budaya yang optimum, ketebalan tisu kartilaginus mencapai 110 μm, organisasi sel dan kolagennya di permukaan dan lapisan dalamnya sama dengan rawan artikular. VKM mengandungi kira-kira 3 kali lebih banyak kolagen dan proteoglikan. Selepas 2 minggu penanaman, pengumpulan matriks-sa telah diperhatikan, yang memungkinkan untuk mengeluarkan tisu dari penuras dan menggunakannya untuk pemindahan.

Sims et al. (1996) mengkaji penanaman chondrocytes dalam matriks polimer encapsulated polyethylene oxide-gel yang membolehkan sejumlah besar sel akan diangkut melalui suntikan. Enam minggu selepas suntikan ke dalam tisu subkutaneus tikus athymic, rawan baru terbentuk, yang secara morfologi dicirikan oleh keupayaan putih yang serupa dengan tulang rawan hyaline. Data dari kajian histologi dan biokimia menunjukkan kehadiran kondomit aktif yang membiak, yang menghasilkan ECM.

Penjelasan

Pemeriksaan tisu kartilaginus digunakan untuk mengkaji proses-proses ana- dan katabolisme di dalamnya, homeostasis, penyegaran dan pembaikan. Chondrocytes dalam tisu cartilaginous menerangkan menyokong fenotip biasa dan komposisi ECM, sama seperti yang terdapat pada tulang rawan artikular di vivo. Selepas 5 hari penanaman di hadapan serum, tahap sintesis yang berterusan dan degradasi semulajadi dicapai. Penyerapan boleh mempercepatkan kultur tisu dan dalam budaya utama dengan tambahan serum menggunakan beberapa ejen, misalnya, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, derivatif asid retinoic atau radikal oksigen aktif. Untuk mengkaji pembaikan tulang rawan, kerosakannya disebabkan oleh mediator larut peradangan (H ₂ O ₂, IL-1, TNF-a) atau pecah fizikal matriks.

Kaedah budaya organotip adalah satu model untuk mengkaji kesan in vitro faktor luaran terpencil pada chondrocytes dan matriks di sekelilingnya. Dalam vivo, kondroit jarang jarang terdapat di ECM dan tidak saling menghubungi. Budaya tulang rawan artikular menjamin organisasi struktur ini, serta interaksi tertentu antara kondroit dan persekitaran ekstrasel sekitarnya. Model ini juga digunakan untuk mengkaji kesan tekanan mekanikal, agen farmakologi, faktor pertumbuhan, sitokin, hormon pada metabolisme tulang rawan.

Satu lagi kelebihan eksplan kondrosit rawan adalah kurangnya kerosakan oleh tindakan enzim proteolitik atau faktor mekanikal yang tidak dapat dielakkan semasa pengasingan sel. Reseptor dan protein membran lain dan glikoprotein dilindungi dari faktor-faktor yang merosakkan.

[17], [18], [19], [20], [21]

Budaya chondrons

Hondron - struktur, fungsi dan metabolik unit artikular rawan terdiri daripada kondrosit matriks pericellular dan kapsul filamen padat dan bertanggungjawab untuk homeostasis matriks. Chondron secara mekanikal dikeluarkan dari tulang rawan dan dikumpulkan oleh beberapa homogenisasi berkelajuan rendah berturut-turut. Diasingkan daripada zon kedalaman yang berbeza rawan hondrony boleh dibahagikan kepada empat kategori: hondron tunggal, hondrony twin, berbilang (tiga atau lebih) hondrony linear diuruskan (ruangan hondronov) kesesakan hondronov.

Hondrony tunggal biasanya ditemui dalam lapisan pertengahan yang utuh rawan, twin - di sempadan tengah dan lapisan dalam linear mempunyai berbilang hondrony khas dari lapisan dalam rawan yang utuh. Akhirnya, kluster-klondongan chondr terdiri daripada kumpulan rondon tunggal dan berpasangan secara rawak yang mengekalkan keadaan agregat selepas homogenisasi. Penyerapan chondr adalah serpihan besar rawan, biasanya mengandungi beberapa chondr dan collagen fibrils berlatarbelakangi, iaitu ciri khas organisasi dalam lapisan dalam matriks. Chondrons tidak bergerak dalam agarose telus, yang membolehkan untuk mengkaji struktur, komposisi molekul dan aktiviti metabolik mereka. Sistem chondron - sistem agarose dianggap sebagai mikromodel rawan, yang berbeza dari sistem kondom tradisional - agarose dalam keadaan alam semulajadi yang dikekalkan, tidak perlu melakukan sintesis dan pemasangannya. Budaya chondron adalah model untuk mengkaji interaksi sel dan matriks dalam rawan artikular pada keadaan normal dan patologi.

[22], [23], [24], [25], [26], [27]

Budaya chondrocytes abadi

Untuk mewujudkan garis sel kekal, DNA rekombinan atau onkogen yang mengandungi virus digunakan yang boleh menjadikan sel "abadi". Chondrocytes abadi mempunyai keupayaan untuk percambahan tanpa henti, mengekalkan fenotip yang stabil. F. Mallein-Gerin et al (1995) menunjukkan bahawa onkogen adalah percambahan SV40T yang disebabkan kondrosit tetikus yang dengan itu terus stabil daftar kolagen II, IX dan XI jenis, dan juga protein yang mengikat bersama dan aggrecan. Walau bagaimanapun, garisan sel tersebut memperoleh keupayaan untuk mensintesis kolagen jenis I apabila dibiakkan dalam budaya monolayer atau dalam gel agarose.

W. Horton dan co-authors (1988) menggambarkan sel sel abnormal dengan tahap mRNA jenis kolagen yang rendah. Sel-sel ini diperoleh dengan mengubahnya dengan retrovirus tetikus yang mengandungi I-myc- dan y-ra-oncogenes. Jenis sel ini adalah satu model yang unik untuk mengkaji interaksi matriks artikular tanpa ketumpatan kolagen jenis II, serta pengawalan sintesis kolagen jenis II.

Budaya chondropytes dengan gen bermutasi atau dipadam adalah satu model mudah untuk mengkaji fungsi fisiologi mereka. Model ini amat sesuai untuk mengkaji peranan molekul tertentu dalam organisasi matriks tulang rawan atau mengkaji kesan pelbagai faktor kawal selia ke atas metabolisme tulang rawan. Kondrosit gen jauh disintesis jenis kolagen gentian halus IX kolagen lebih luas daripada biasa, yang menunjukkan bahawa jenis kolagen IX mengawal diameter gentian halus. Seperti yang dinyatakan dalam Bab 1, mutasi kolagen jenis COLAI pengekodan dalam keluarga dengan osteoartritis umum yang baru telah dikesan. Untuk mengkaji kesan mutan kolagen jenis II dalam matriks artikular R. Dharmrvaram et al (1997) dilakukan transfection ( "pencemaran" asid nukleik asing) COL rosak ₂ AI (arginine pada kedudukan 519 digantikan dengan cysteine) dalam kondrosit janin manusia dalam vitro.

Sistem kultur. Dalam sendi, tulang rawan berinteraksi dengan sel-sel jenis lain yang terkandung dalam membran sinovial, cecair sinovial, ligamen, tulang subkondral. Metabolisme chondrocytes boleh dipengaruhi oleh pelbagai faktor larut yang disintesis oleh sel-sel ini. Oleh itu, arthritis rawan artikular dijana oleh enzim proteolitik dan radikal bebas, yang dihasilkan oleh sel-sel sinovial. Oleh itu, model telah dibangunkan untuk mengkaji interaksi kompleks antara tulang rawan dan tisu di sekeliling, yang dipanggil kokultur.

S. Lacombe-Gleise et al (1995) adalah kondrosit arnab berbudaya dan osteoblas dalam sistem coculture yang (CoStar), di mana sel-sel telah dipisahkan membran microporous (0.4 mikron) membolehkan pertukaran antara kedua-dua jenis sel tanpa apa-apa hubungan langsung. Kajian ini menunjukkan keupayaan osteoblas untuk merangsang pertumbuhan kondroit melalui mediator yang larut.

A.M. Malfait dan co-authors (1994) menyelidik hubungan antara monosit darah perifer dan kondroit. Model ini mudah untuk mengkaji proses-proses yang ditengahi oleh sitokin, dalam artritis inflamasi (arthritis rheumatoid, spondylitis seronegatif, dan lain-lain). Penulis model memisahkan sel-sel oleh membran protein-mengikat dengan pori diameter 0.4 μm. Kajian mendapati bahawa monosit lipopolysaccharide-dirangsang diusahakan iFNO IL-1-a, yang menghalang sintesis kondrosit aggrecan dan menyumbang kepada kemusnahan agregat aggrecan telah disintesis.

K. Tada et al (1994) mencipta satu model coculture di mana sel-sel endothelial dalam kolagen (I-jenis) gel telah dimasukkan ke dalam ruang dalaman dari ruang luar dipisahkan daripadanya oleh kondrosit diletakkan di dalam penapis dengan saiz liang 0.4 mikron. Dalam keadaan penebat penuh dari ruang luar tiub sel endothelial manusia terbentuk dalam gel kolagen di hadapan EGF atau TGF-a. Dengan penanaman serentak kedua-dua jenis sel TGF, pembentukan tabung bergantung oleh sel-sel endothelial dihalang. Penghambatan chondrocyte proses ini sebahagiannya dihapuskan oleh antibodi anti-TGF-beta. Ia boleh diandaikan bahawa beta TGF yang dihasilkan oleh kondroit merendahkan vascularization rawan itu sendiri.

S. Groot dan co-authors (1994) secara serentak menanam chondrocytes dari zon hipertropik dan proliferatif tulang tikus janin berusia 16 hari dengan kepingan tisu otak. Selepas 4 hari budaya, transdifferentiation chondrocytes ke osteoblast dan permulaan pembentukan osteoid diperhatikan. Selepas 11 hari penanaman, sebahagian tulang rawan digantikan oleh tisu tulang dan matriks tulang sebahagiannya dikalsum. Sesetengah neuropeptida dan neurotransmitter yang dihasilkan oleh tisu otak, menjejaskan metabolisme osteoblas atau mempunyai reseptor pada mereka. Antaranya, norepinephrine, peptida usus vasoaktif, peptida yang berkaitan dengan gen kaltitin, bahan P dan somatostatin boleh diasingkan . Dibina dengan chondrocytes, kepingan tisu otak dapat menghasilkan beberapa faktor ini, yang dapat menyebabkan proses transdifferentiasi chondrocyte menjadi osteoblas.

[28], [29], [30], [31], [32], [33]

Pengaruh faktor luaran pada budaya chondrocytes

Kesan ketegangan oksigen pada metabolisme chondrocytes

Dalam kebanyakan kes, budaya chondrocyte berkembang di bawah keadaan ketegangan oksigen atmosfera. Walau bagaimanapun, diketahui bahawa dalam vivo kondroit terdapat di bawah keadaan hipoksik dan ketegangan oksigen berbeza dengan keadaan patologi yang berbeza. Semasa proses kematangan, perubahan ketara dalam bekalan darah epifisis diperhatikan. Oleh kerana vascularization berbeza-beza di kawasan berlainan plat pertumbuhan, ketegangan oksigen di dalamnya juga berbeza-beza. C. Brighton dan R. Heppenstall (1971) menunjukkan bahawa dalam plat tibia dalam arnab, ketegangan oksigen dalam zon hipertropik kurang daripada rawan di sekelilingnya. Pengukuran beberapa parameter metabolik telah menunjukkan bahawa chondrocytes dapat bertindak balas dengan cepat kepada perubahan tempatan dalam kepekatan oksigen. Pertama sekali, dengan ketegangan oksigen yang rendah, pengambilan chondrocytes berkurangan. Dengan penurunan ketegangan oksigen dari 21 hingga 0.04%, penggunaan glukosa meningkat, aktiviti enzim glikolisis dan sintesis asid laktik meningkat. Walaupun dengan ketegangan oksigen yang rendah, jumlah mutlak ATP, ADP, dan AMP kekal stabil. Data ini menunjukkan arah aliran metabolisme chondrocyte untuk memaksimumkan pemuliharaan tenaga. Walau bagaimanapun, aktiviti sintetik, dan dengan itu proses pembetulan, berubah di bawah keadaan hipoksia.

Ketegangan oksigen yang tinggi juga mempengaruhi metabolisme kondroit, menyebabkan pengurangan sintesis protein dan DNA, penurunan matriks rawan. Kesan-kesan ini, sebagai peraturan, disertai dengan pengeluaran radikal oksigen bebas.

Pengaruh kepekatan ion dan tekanan osmosis persekitaran terhadap fungsi kondroit

Dalam kepekatan ion rawan asli adalah jauh berbeza daripada tisu-tisu lain: Kandungan natrium dalam medium extracellular adalah 250-350 mmoles dan osmolarity yang - 350-450 mOsm. Apabila mengasingkan kondrosit dari VCR dan merangsang mereka dalam media standard (DMEM (Medium Essential Minimal Dulbecco kanak - Dulbecco yang Minimum sederhana Perlu) osmolarity - 250-280,7 mOsm) perubahan mendadak sekitar persekitaran sel. Di samping itu, kepekatan kalsium dan kalium dalam media standard jauh lebih rendah daripada tisu asli, dan kepekatan anion adalah lebih tinggi.

Penambahan sukrosa ke medium membawa kepada peningkatan osmolariti dan mendorong peningkatan intraselular sementara dalam kepekatan H ⁺ dan anion kalsium dalam sitosol. Perubahan intrasel seperti itu boleh mempengaruhi proses pembedahan chondrocyte dan aktiviti metabolik mereka. J. Urban et al (1993) mendapati bahawa kemasukan ³⁵ 8-sulfat dan ³ H-proline kondrosit terpencil dieram dalam DMEM medium standard untuk 2-4 jam, hanya 10% daripada yang dalam tisu asli. Keamatan sintesis mencapai maksimum dengan osmolarity dari medium ekstraselular 350-400 mosmol kedua-duanya dalam kondroit yang baru terisolasi dan dalam penemuan tisu kartilaginus. Selain itu, jumlah chondrocyte meningkat sebanyak 30-40% selepas meletakkan sel terpencil dalam medium DMEM standard osmolariti tersebut. Walau bagaimanapun, dalam penanaman chondrocytes di bawah osmolariti nonphysiological selama 12-16 h, sel-sel menyesuaikan diri dengan keadaan baru, mengurangkan keamatan biosintesis berkadaran dengan osmolariti medium luar.

P. Borgetti et al (1995) menyiasat kesan osmolarity sederhana extracellular kepada pertumbuhan, morfologi, dan biosintesis kondrosit babi. Para penulis menunjukkan ciri-ciri biokimia dan morfologi yang serupa dalam kultur kondom dalam media dengan osmolarity 0.28 dan 0.38 mosmol. Apabila 0.48 mOsm osmolarity sederhana semasa 4-6 jam pertama budaya diperhatikan penurunan dalam percambahan sel dan sintesis protein, tetapi kemudiannya berlaku mengembalikan parameter ini yang akhirnya mencapai nilai-nilai kawalan. Apabila pengkulturan kondrosit dalam medium dengan sel-sel osmolarity 0.58 mOsm kehilangan keupayaan mereka untuk menyokong intensiti fisiologi proses proliferatif dan selepas 6 hari jumlah kondrosit semakin berkurangan. Dengan osmolariti medium, 0.58 mosmol, perencatan dalam sintesis protein diperhatikan. Di samping itu, apabila berbudaya dalam media dengan osmolarity yang mOsm 0,28-0,38 kondrosit mengekalkan phenotype fisiologi di osmolarity yang lebih tinggi (mOsm 0,48-0,58) perubahan ketara dalam morfologi sel, kehilangan Ditunjukkan phenotype ciri kondrosit penukaran ke dalam sel seperti fibroblast, serta kehilangan sel, keupayaan untuk memasang proteoglikan matriks. Hasil kajian ini menunjukkan keupayaan kondroit untuk bertindak balas terhadap osmolality terhad di persekitaran ekstraselular.

Perubahan kepekatan ion lain juga boleh mempengaruhi proses biosintesis dalam kondroit. Oleh itu, tahap kemasukan ³⁵ S (sulfat) meningkat sebanyak separuh dengan peningkatan kepekatan ion kalium dari 5 mmol (kepekatan dalam DM DM sederhana) hingga 10 mmol (kepekatan VKM dalam vivo). Kepekatan kalsium di bawah 0.5 mmol menyumbang kepada pengeluaran kolagen oleh chondrocytes lembu matang, manakala kepekatan 1-2 mmol (bersamaan dengan kepekatan dalam DM DM sederhana) menyebabkan pengurangan kolagen sintesis yang ketara. Peningkatan sederhana dalam biosintesis diperhatikan pada tahap tinggi kalsium (2-10 mmol). Pelbagai kation mengambil bahagian dalam lampiran kondroit dengan protein VKM. Oleh itu, ion magnesium dan mangan menyediakan lampiran kepada fibronektin dan kolagen jenis II, manakala ion kalsium tidak terlibat dalam lampiran kondroit dengan protein. Oleh itu, hasil kajian yang diterangkan menunjukkan pengaruh perubahan ion ekstraselular kalium, natrium, kalsium dan osmolariti medium pada fungsi biosynthetic chondrocytes yang diinkubasi dalam media standard.

Pengaruh tekanan mekanikal pada metabolisme chondrocytes

Imobilisasi sendi menyebabkan atrofi boleh terbalik rawan, yang menunjukkan keperluan untuk rangsangan mekanikal untuk proses normal proses metabolik dalam ECM. Dalam kebanyakan kes, model kultur sel yang digunakan wujud di bawah keadaan tekanan atmosfera biasa. M. Wright dan co-authors (1996) menunjukkan bahawa persekitaran mekanikal mempengaruhi metabolisme chondrocytes, tindak balas sel bergantung kepada intensiti dan kekerapan beban mampatan. Eksperimen dengan pemuatan pada eksplan tulang rawan artikular utuh dalam vitro menunjukkan penurunan dalam sintesis protein dan proteoglisans di bawah tindakan beban statik, manakala beban dinamik merangsang proses-proses ini. Mekanisme yang tepat untuk merealisasikan kesan tekanan mekanik pada tulang rawan yang rumit dan mungkin berkaitan dengan ubah bentuk sel, tekanan hidrostatik, tekanan osmotik, potensi elektrik dan reseptor selular permukaan ke molekul matriks. Untuk mengkaji kesan setiap parameter ini, perlu membuat sistem di mana satu parameter boleh diubah secara berasingan. Contohnya, menerangkan budaya tidak sesuai untuk mengkaji ubah bentuk sel, tetapi ia boleh digunakan untuk mengkaji kesan keseluruhan tekanan pada aktiviti metabolik chondrocytes. Mampatan rawan membawa kepada sel ubah bentuk, dan juga disertai oleh kejadian kecerunan hidrostatik tekanan, potensi elektrik, dan aliran bendalir perubahan fizikokimia faktor seperti kandungan air dalam matriks, ketumpatan cas elektrik, tahap tekanan osmosis. Pengubahan sel boleh dikaji menggunakan chondrocytes terpencil yang direndam dalam gel agarose atau kolagen.

Beberapa sistem telah dibangunkan untuk mengkaji kesan rangsangan mekanikal terhadap budaya chondrocytes. Sesetengah penyelidik menggunakan sistem untuk tujuan ini di mana tekanan digunakan pada budaya sel melalui fasa gas. Sebagai contoh, JP Veldhuijzen et al (1979) menggunakan tekanan di atas atmosfera 13 kPa pada frekuensi yang rendah (0.3 Hz) selama 15 minit, diperhatikan peningkatan dalam sintesis kem dan proteoglikan dan mengurangkan sintesis DNA. R. Smith et al (1996) menunjukkan bahawa pendedahan sekejap budaya utama kondrosit lembu tekanan hidrostatik (10 MPa) pada 1 Hz untuk 4 jam disebabkan peningkatan sintesis aggrecan dan kolagen jenis II, manakala tekanan berterusan mempunyai kesan ke atas proses ini. Menggunakan sistem yang sama M. Wright et al (1996) melaporkan bahawa tekanan kitaran kultur sel yang dikaitkan dengan hyperpolarization membran sel kondrosit dan pengaktifan Ca ²⁺ saluran kalium -dependent. Oleh itu, kesan tekanan kitaran dikawal oleh saluran ion, diaktifkan dengan regangan, dalam membran chondrocyte. Sambutan chondrocytes kepada tekanan hidrostatik bergantung kepada keadaan budaya sel dan kekerapan beban yang digunakan. Oleh itu, tekanan hidrostatik kitaran (5 MPa) mengurangkan diperbadankan sulfat ke dalam kondrosit monolayer pada frekuensi 0.05, 0.25 dan 0.5 Hz, manakala bagi frekuensi melebihi 0.5 Hz kemasukan sulfat dalam rawan eksplan bertambah.

M. Bushmann et al (1992) melaporkan bahawa kondroit dalam gel agarose mengubah biosintesis sebagai tindak balas kepada tekanan mekanik statik dan dinamik dengan cara yang sama seperti organ utuh yang berbudaya. Penulis mendapati bahawa beban mekanikal menghasilkan rangsangan hiperosmotik diikuti dengan penurunan pH dalam kondroit.

Kesan pembesaran mekanikal boleh dikaji pada budaya sel yang direndam dalam gel. Daya regangan boleh dibuat menggunakan vakum dikendalikan komputer. Apabila sistem berada dalam vakum tahap tertentu, bahagian bawah hidangan Petri dengan budaya sel diperpanjang dengan jumlah tertentu, ubah bentuk adalah maksimal di tepi bahagian bawah cawan dan sedikit di tengah. Peregangan ditransmisikan dan dibiakkan dalam hidangan petri chondrocytes. Dengan bantuan kaedah ini, Holm-vall dan co-authors (1995) telah menunjukkan bahawa ungkapan mRNA daripada α ₂ -integrin meningkat dalam kolagen kultur kolagen (jenis II) sel chondrosarcoma . Dan ₂ p _g integrin mampu mengikat kolagen II. Ia dianggap sebagai mekanoreceptor, kerana ia berinteraksi dengan protein yang mengikat aktin, dengan demikian menyambungkan ECM dan sitoskeleton.

Kesan pH pada Metabolisme Chondrocyte

PH cecair interstitial ECM daripada tisu cartilaginous lebih berasid berbanding dengan tisu lain. A. Maroudas (1980) menentukan pH rawan artikular pada 6.9. W. Diamant dan co-authors (1966) mendapati pH 5.5 dalam keadaan patologi. Adalah diketahui bahawa kondroitit hidup pada PO2 rendah, yang menunjukkan peranan penting glikolisis (95% daripada jumlah metabolisme glukosa) dalam metabolisme sel-sel ini; glikolisis disertai dengan pengeluaran sejumlah besar asid laktik.

Sebagai tambahan kepada pengasidan alam sekitar dengan produk glikolisis, komponen matriks sendiri sangat penting. Sebilangan besar cas negatif ditetapkan pada proteoglikan extracellular mengubah komposisi ionik: terdapat kepekatan yang tinggi kation percuma (cth H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) dan kepekatan rendah anion (mis, O2, NPHS). Selain itu, di bawah pengaruh beban mekanikal, air diusir dari ECM, yang menyebabkan peningkatan kepekatan caj negatif tetap dan tarikan lebih banyak kation ke matriks. Ini disertai dengan penurunan dalam pH media ekstraselular, yang mempengaruhi pH intraselular, dengan itu mengubah metabolisme chondrocytes. R. Wilkin dan A. Hall (1995) mengkaji kesan pH medium ekstraselular dan intraselular pada biosintesis matriks oleh kavohit bull terisolasi. Mereka memerhatikan pengubahsuaian dua sintesis matriks dengan penurunan pH. A sedikit penurunan dalam pH (7.4 35 S0 ₄ dan ³ H-proline ke kondrosit, manakala pengasidan lebih mendalam (pH <7.1) menghalang sintesis sebanyak 75% berbanding dengan kawalan. Mencipta pH yang rendah (6.65) yang sama dengan ion amonium menyebabkan penurunan dalam sintesis matriks oleh hanya 20%. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahawa pengubahsuaian pH medium sintesis matriks ekstraselular tidak dapat dijelaskan hanya oleh perubahan dalam pH medium intraselular. Tambahan pula, kondrosit mempunyai keupayaan untuk mengawal pH intraselular oleh Na ⁺, H ⁺ penukar, Ca ⁺ -dependent C1 ^_ -NSOZ -CONVEYORS dan H ⁺ / ATPase.

[34], [35], [36], [37], [38], [39], [40]

Kesan komposisi medium untuk penanaman pada metabolisme chondrocytes

Medium untuk mengkultur chondrocytes mesti sesuai dengan keadaan percubaan. Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, serum betis telah digunakan untuk mengoptimumkan keadaan budaya. Walau bagaimanapun, apabila menggunakan serum, beberapa perkara penting perlu dipertimbangkan:

• pertumbuhan luaran sel-sel dari pinggiran tisu dalam budaya organ,
• variasi komposisi sera pelbagai siri,
• kehadiran komponen yang tidak diketahui di dalamnya,
• peningkatan risiko gangguan, artifak dalam kajian pengaruh pelbagai faktor biologi pada aktiviti metabolik sel.

Contohnya ialah kajian kesan EGF pada chondrocytes tulang rawan pada tikus. EGF merangsang penggabungan ³ H-thymidine dan peningkatan kandungan DNA dalam budaya. Kesan ini lebih ketara pada kepekatan serum rendah (<1%), tetapi pada kepekatan tinggi (> 7.5%) kesannya hilang.

Adalah diketahui bahawa tahap sintesis dan degradasi dalam DMEM diperkaya dengan serum betina meningkat dengan ketara berbanding dengan keadaan vivo. Perbezaan antara metabolisme vivo dan in vitro boleh disebabkan oleh perbezaan antara cecair sinovial dan persekitaran di mana sel-selnya dibiakkan. D. Lee et al (1997) adalah kondrosit berbudaya lembu-lembu jantan agarose menggunakan medium nutrien yang mengandungi DMEM, diperkaya dengan 20% anak lembu serum dan sejumlah besar cecair sinovia normal allogeneic. Kehadiran cecair sinovial dalam medium menyebabkan peningkatan jumlah proteoglia, sehingga 80% dari jumlah cairan synovial. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahawa cecair sinovial dalam budaya menginduksi kadar metabolik yang serupa dengan yang di vivo, dengan tahap sintesis tinggi glycosaminoglycans dan tahap pembahagian sel yang rendah.

G. Verbruggen et al (1995) menunjukkan bahawa sintesis ³⁵ S-arrpeKaHa kondrosit manusia berbudaya dalam agarose dalam DMEM tanpa serum adalah 20-30% daripada tahap sintesis diperhatikan dalam DMEM, ditambah dengan 10% anak lembu serum. Penulis menentukan sejauh di mana IGF-1, IGF-2, TGF-P atau dikurangkan aggrecan pengeluaran insulin dalam medium tanpa serum. Penulis membuat kesimpulan bahawa 100 ng insulin / ml, IGF-1 atau IGF-2 sebahagiannya dikurangkan sintesis aggrecan untuk 39-53% daripada tahap kawalan. Dengan gabungan faktor-faktor ini, tiada fenomena sinergi atau kumulatif telah dikenalpasti. Pada masa yang sama, 10 ng / ml TGF-P di hadapan 100 insulin ng / ml merangsang sintesis aggrecan 90% atau lebih daripada tahap rujukan. Akhir sekali, transferrin serum, bersendirian atau dalam kombinasi dengan insulin, tidak menjejaskan sintesis aggrecan. Apabila serum anak lembu diganti dengan albumin serum lembu, kandungan agregat aggrecan berkurang dengan ketara. Medium budaya pengayaan dengan insulin, IGF, atau TGF-P sebahagiannya dipulihkan keupayaan sel-sel untuk menghasilkan agregat aggrecan. Dalam kes ini, IGF-1 dan insulin dapat mengekalkan homeostasis dalam budaya sel. Selepas 40 hari budaya dalam sederhana ditambah dengan 10-20 ng / ml IGF-1, sintesis proteoglikan dikekalkan pada tahap yang sama atau lebih tinggi berbanding dengan medium yang mengandungi 20% anak lembu serum. Proses katabolik berjalan perlahan-lahan dalam jangka sederhana ditambah dengan IGF-1 berbanding sederhana ditambah dengan 0.1% penyelesaian albumin, tetapi lebih pantas dalam medium ditambah dengan 20% serum. Dalam budaya hidup yang panjang, 20 ng / ml IGF-1 mengekalkan keadaan sel yang stabil.

D. Lee et al (1993) berbanding kesan komposisi medium budaya (DMEM, DMEM + 20% anak lembu serum, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) di sintesis DNA dalam budaya rawan eksplan, budaya monolayer dan terapung di dalam agarose . Apabila dibudidayakan dalam agarose dengan kehadiran serum, penulis mendapati kecenderungan untuk mengelompokkan kondroit ke dalam kelompok besar. Sel kultur tanpa serum dan dengan IGF1, mengekalkan bentuk bulat dalam agarose, dikumpulkan dalam kumpulan kecil, tetapi tidak membentuk agregat besar. Dalam monolayer, sintesis DNA jauh lebih tinggi dalam media yang mengandungi serum daripada medium yang diperkaya dengan IGF-1; Sintesis DNA di dalamnya lebih tinggi daripada persekitaran yang tidak disengajakan. Apabila pengkulturan kondrosit terapung di dalam agarose dalam medium unconcentrated dan dalam medium dengan IGF-1, tidak ada perbezaan dalam sintesis DNA. Pada masa yang sama buburan pengkulturan kondrosit di agarose dalam medium ditambah dengan serum, diiringi oleh diperbadankan peningkatan radionucleotide ³ H-thymidine berbanding persekitaran yang lain.

Vitamin C diperlukan untuk pengaktifan enzim yang terlibat dalam pembentukan struktur lingkaran yang stabil fibrils kolagen. Chondrocytes, kekurangan berkenaan dengan asid askorbik, mensintesis kolagen awal yang tidak hidroksilasi, yang perlahan-lahan dirembeskan. Pengenalan asid askorbik (50 μg / ml) menyebabkan hidroksilasi jenis kolagen II dan IX dan rembesannya dalam jumlah biasa. Penambahan vitamin C tidak menjejaskan tahap sintesis proteoglikan. Akibatnya, rembesan kolagen dikawal secara bebas daripada rembesan proteoglikan.

[41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]