Punca dan patogenesis difteria

Difteria adalah paradigma penyakit berjangkit toksik. Pada tahun 1883, Klebs menunjukkan bahawa Corynebacterium diphtheriae adalah agen penyebab difteria. Setahun kemudian, Loeffler mendapati bahawa organisma itu boleh dibiakkan hanya dari rongga nasofaring dan mencadangkan bahawa kerosakan pada organ dalaman adalah disebabkan oleh toksin larut. Menjelang 1888, Roux dan Yersin menunjukkan bahawa haiwan yang disuntik dengan turasan steril C. diphtheriae membangunkan patologi organ yang tidak dapat dibezakan daripada difteria manusia; ini menunjukkan bahawa eksotoksin yang kuat adalah faktor virulensi utama.

Difteria selalunya adalah jangkitan saluran pernafasan atas yang menyebabkan demam, sakit tekak dan rasa tidak enak badan. Membran fibrin yang tebal, kelabu-hijau, pseudomembrane, sering terbentuk di tapak jangkitan akibat kesan gabungan pertumbuhan bakteria, pengeluaran toksin, nekrosis tisu asas dan tindak balas imun perumah. Pengiktirafan bahawa kerosakan organ sistemik disebabkan oleh tindakan toksin difteria telah membawa kepada pembangunan kedua-dua terapi berasaskan antitoksin yang berkesan untuk rawatan jangkitan akut dan vaksin toksoid yang sangat berkesan.

Walaupun imunisasi toksoid telah menjadikan difteria sebagai penyakit yang jarang berlaku di kawasan di mana standard kesihatan awam memerlukan vaksinasi, wabak difteria masih berlaku dalam kumpulan yang tidak diimunisasi dan imunokompromi. Sebaliknya, wabak difteria yang meluas mencapai kadar wabak telah berlaku di kawasan di mana program imunisasi aktif telah digantung.

Jenis lain corynebacteria

Selain C. diphtheriae, C. ulcerans, dan C. pseudotuberculosis, C. pseudodiphtheriticum dan C. xerosis kadangkala boleh menyebabkan jangkitan nasofaring dan kulit. Dua strain terakhir boleh dikenali dengan keupayaan mereka untuk menghasilkan pyrazinamidase. Dalam perubatan veterinar, C. renale dan C. kutscheri adalah patogen penting, masing-masing menyebabkan pyelonephritis pada lembu dan jangkitan laten pada tikus.

Punca

Agen penyebab difteria, Corynebacterium diphtheriae, ialah batang nipis, sedikit melengkung dengan penebalan berbentuk kelab di hujungnya, tidak bergerak; ia tidak membentuk spora, kapsul atau flagela, dan gram positif.

Sebagai tambahan kepada toksin, difteria corynebacteria menghasilkan neuraminidase, hyaluronidase, hemolysin, necrotizing dan faktor meresap semasa proses hidup mereka, yang boleh menyebabkan nekrosis dan pencairan bahan utama tisu penghubung.

Berdasarkan keupayaan mereka untuk membentuk toksin, difteria corynebacteria dibahagikan kepada toksigenik dan bukan toksigenik.

Toksin difteria ialah eksotoksin bakteria kuat yang menentukan kedua-dua manifestasi klinikal umum dan tempatan penyakit ini. Ketoksikan ditentukan secara genetik. Corynebacteria bukan toksik difteria tidak menyebabkan penyakit ini.

Mengikut ciri budaya dan morfologi, semua corynebacteria difteria dibahagikan kepada 3 varian: gravis, mitis, intermedius. Tiada pergantungan langsung keparahan penyakit pada varian corynebacteria difteria. Setiap varian mengandungi kedua-dua strain toksigenik dan bukan toksigenik. Corynebacteria toksik dari semua varian menghasilkan toksin yang sama. [ 1 ]

Struktur, klasifikasi dan jenis antigen

Corynebacterium diphtheriae ialah batang Gram-positif, tidak motil, berbentuk kelab. Strain yang tumbuh dalam tisu atau kultur in vitro yang lebih tua mengandungi bintik-bintik halus di dinding sel yang membolehkan penyahwarnaan semasa pewarnaan Gram dan mengakibatkan tindak balas Gram berubah-ubah. Kultur lama selalunya mengandungi butiran metachromatic (polymetaphosphate) yang mengotorkan ungu kebiruan dengan metilena biru. Gula dinding sel termasuk arabinosa, galaktosa, dan mannose. Di samping itu, toksik 6,6'-ester trehalosa boleh diasingkan, mengandungi asid corynemycolic dan corynemycolenic dalam kepekatan equimolar. Tiga jenis budaya yang berbeza diiktiraf: mitis, intermedius, gravis.

Kebanyakan strain memerlukan asid nikotinik dan pantotenat untuk pertumbuhan; sesetengahnya juga memerlukan tiamin, biotin, atau asid pimelik. Untuk pengeluaran toksin difteria yang optimum, medium mesti ditambah dengan asid amino dan mesti diketepikan.

Seawal tahun 1887, Loeffler menerangkan pengasingan avirulen (bukan toksik) C. diphtheriae yang tidak dapat dibezakan daripada strain virulen (toksikgenik) yang diasingkan daripada pesakit dalam individu yang sihat. Kini diakui bahawa strain avirulen C. diphtheriae boleh ditukar kepada fenotip virulen berikutan jangkitan dan lisogenisasi oleh salah satu daripada beberapa corynebacteriophages berbeza yang membawa gen struktur untuk toksin difteria, tox. Penukaran lisogenik bagi fenotip avirulen kepada virulen boleh berlaku secara in situ dan in vitro. Gen struktur untuk toksin difteria tidak penting untuk sama ada corynebacteriophage atau C. diphtheriae. Walaupun pemerhatian ini, hanyutan genetik toksin difteria tidak diperhatikan.

[ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Patogenesis

Titik kemasukan jangkitan adalah selaput lendir orofarinks, hidung, laring, kurang kerap membran mukus mata dan alat kelamin, serta kulit yang rosak, permukaan luka atau terbakar, ruam lampin, luka umbilik yang tidak sembuh. Di pintu masuk, difteria corynebacterium membiak dan merembeskan eksotoksin.

Eksudat yang kaya dengan fibrinogen dipancarkan dan ditukar menjadi fibrin di bawah pengaruh trombokinase yang dikeluarkan semasa nekrosis sel epitelium. Filem fibrinous terbentuk - tanda ciri difteria.

Pengangkutan nasofaring tanpa gejala adalah perkara biasa di kawasan endemik difteria. Pada individu yang mudah terdedah, strain toksigenik menyebabkan penyakit dengan mereplikasi dan merembeskan toksin difteria dalam nasofaring atau lesi kulit. Lesi difteria selalunya dilindungi oleh pseudomembrane yang terdiri daripada fibrin, bakteria, dan sel-sel radang. Toksin difteria boleh dipecahkan secara proteolitik kepada dua serpihan: serpihan N-terminal A (domain pemangkin) dan serpihan B (domain transmembran dan pengikat reseptor). Fragmen A memangkinkan NAD+-bergantung kepada ADP-ribosilasi faktor pemanjangan 2, dengan itu menghalang sintesis protein dalam sel eukariotik. Serpihan B mengikat kepada reseptor permukaan sel dan memudahkan penghantaran serpihan A ke sitosol.

Imuniti perlindungan melibatkan tindak balas antibodi terhadap toksin difteria selepas penyakit klinikal atau toksin difteria (toksin yang dinyahaktifkan oleh formaldehid) selepas imunisasi.

Penjajahan

Sedikit yang diketahui tentang faktor yang menjadi pengantara penjajahan C. diphtheriae. Walau bagaimanapun, adalah jelas bahawa faktor selain daripada pengeluaran toksin difteria menyumbang kepada virulensi. Kajian epidemiologi telah menunjukkan bahawa lisotip tertentu boleh bertahan dalam populasi untuk jangka masa yang lama. Ia kemudiannya boleh digantikan dengan lisotip lain. Kemunculan dan penguasaan seterusnya lisotaip baru dalam populasi mungkin berkaitan dengan keupayaannya untuk menjajah dan bersaing secara berkesan dalam segmen niche ekologi nasofaring. Corynebacterium diphtheriae boleh menghasilkan neuraminidase, yang membelah asid sialik permukaan sel kepada komponennya piruvat dan asid N-acetylneuraminic. Faktor kord (6,6'-di-O-mycoloyl-α, α'-D-trehalose) ialah komponen permukaan C. diphtheriae, tetapi peranannya dalam penjajahan perumah manusia tidak jelas.

Pengeluaran toksin difteria

Gen struktur toksin difteria, tox, tergolong dalam keluarga corynebacteriophages yang berkait rapat, yang mana β-phage adalah yang terbaik dikaji. Peraturan ekspresi toksin difteria dimediasi oleh penindas diaktifkan besi, DtxR, yang dikodkan oleh genom C. diphtheriae. Ekspresi toksin bergantung kepada keadaan fisiologi C. diphtheriae. Di bawah keadaan di mana besi menjadi substrat pengehad kadar pertumbuhan, besi tercerai daripada DtxR, gen toksikodendron menjadi diaktifkan, dan toksin difteria disintesis dan dirembeskan ke dalam medium kultur pada kadar maksimum.

Toksin difteria sangat kuat; untuk spesies yang mudah terdedah (cth. manusia, monyet, arnab, guinea pig) sekurang-kurangnya 100 hingga 150 ng/kg berat badan adalah maut. Toksin difteria terdiri daripada rantai polipeptida tunggal 535 asid amino. Analisis struktur biokimia, genetik dan sinar-X menunjukkan bahawa toksin terdiri daripada tiga domain struktur/fungsi:

• N-terminal ADP-ribosiltransferase (domain pemangkin);
• rantau yang memudahkan penghantaran domain pemangkin merentasi membran sel (domain transmembrane);
• domain pengikat reseptor sel eukariotik.

Berikutan penghadaman dan pengurangan trypsin yang ringan di bawah keadaan denaturasi, toksin difteria boleh dibelah secara khusus pada gelung sensitif proteasenya kepada dua serpihan polipeptida (A dan B). Fragmen A ialah komponen N-terminal 21 kDa bagi toksin dan mengandungi tapak pemangkin untuk ADP-ribosilasi faktor pemanjangan 2 (EF-2)

Gambar rajah reben struktur kristal sinar-X toksin difteria asli monomerik. (diubah suai daripada Bennett MJ, Choe S, Eisenberg D: Pertukaran domain: Menjerat hubungan antara protein. Proc Natl Acad Sci, USA, 91: 3127, 1994). Kedudukan relatif domain pemangkin, transmembran, dan pengikat reseptor ditunjukkan. Toksin utuh boleh dibelah oleh protease seperti trypsin di Arg190, Arg192, dan/atau Arg193, yang terletak dalam gelung sensitif protease (PSL). Berikutan pengurangan jambatan disulfida antara Cys186 dan Cys201, toksin boleh diselesaikan menjadi serpihan A dan B. Terminal amino (N) dan terminal karboksi (C) toksin utuh ditunjukkan. Carta jalur dicipta menggunakan program MOLESCRIPT.

Serpihan C-terminal, serpihan B, membawa domain transmembran dan pengikat reseptor toksin.

Keracunan satu sel eukariotik oleh toksin difteria melibatkan sekurang-kurangnya empat langkah yang berbeza:

1. pengikatan toksin kepada reseptornya pada permukaan sel;
2. pengelompokan reseptor bercas ke dalam lubang bersalut dan penghayatan toksin melalui endositosis pengantara reseptor; berikutan pengasidan vesikel endositik oleh pam proton dipacu ATP yang berkaitan membran,
3. memasukkan domain transmembran ke dalam membran dan memudahkan penghantaran domain pemangkin ke dalam sitosol, dan
4. ADP-ribosilasi EF-2, mengakibatkan penindasan sintesis protein yang tidak dapat dipulihkan.

Telah ditunjukkan bahawa satu molekul domain pemangkin yang dihantar ke dalam sitosol adalah mencukupi untuk membawa maut kepada sel.

Gambarajah skematik mabuk difteria sel eukariotik yang mudah terdedah.

Toksin terikat pada reseptor permukaan selnya dan dihayati melalui endositosis pengantara reseptor; selepas pengasidan endosom, domain transmembran dimasukkan ke dalam membran vesikel; domain pemangkin dihantar ke sitosol, yang membawa kepada perencatan sintesis protein dan kematian sel.

Epidemiologi

Sebelum imunisasi besar-besaran penduduk AS dengan toksoid difteria, difteria biasanya merupakan penyakit kanak-kanak. Aspek imunisasi besar-besaran dengan toksoid difteria yang luar biasa ialah apabila peratusan populasi dengan tahap perlindungan imuniti antitoksin (≥ 0.01 IU/mL) meningkat, kekerapan pengasingan strain toksigenik daripada populasi berkurangan. Hari ini, di Amerika Syarikat, di mana difteria klinikal telah hampir hilang sepenuhnya, pengasingan strain toksik C. diphtheriae jarang berlaku. Oleh kerana jangkitan subklinikal tidak lagi menyediakan sumber pendedahan kepada antigen difteria dan, melainkan dirangsang, imuniti terhadap antitoksin berkurangan, peratusan besar orang dewasa (30 hingga 60%) mempunyai paras antitoksin di bawah paras perlindungan dan berisiko. Di Amerika Syarikat, Eropah dan Eropah Timur, wabak difteria baru-baru ini telah berlaku terutamanya dalam kalangan individu yang menyalahgunakan alkohol dan/atau dadah. Dalam kumpulan ini, pembawa toksigenik C. diphtheriae mempunyai tahap imuniti antitoksik yang sederhana tinggi. Pecahan langkah kesihatan awam di Rusia baru-baru ini telah mengakibatkan difteria menjadi wabak. Menjelang akhir tahun 1994, lebih daripada 80,000 kes dan lebih daripada 2,000 kematian telah dilaporkan di Rusia.

Wabak fokus difteria hampir selalu dikaitkan dengan pembawa imun yang telah kembali dari kawasan di mana difteria adalah endemik. Malah, wabak difteria klinikal baru-baru ini di Amerika Syarikat dan Eropah telah dikaitkan dengan pelancong yang pulang dari Rusia dan Eropah Timur. Strain toksik C. diphtheriae dihantar terus dari orang ke orang melalui titisan bawaan udara. Adalah diketahui bahawa strain toksigenik secara langsung boleh menjajah rongga nasofaring. Di samping itu, gen toksigenik boleh disebarkan secara tidak langsung melalui pembebasan corynebacteriophage toksik dan transformasi lisogenik C. diphtheriae in situ autochthonous bukan toksik. [ 5 ]

Sebagai tambahan kepada penentuan biotaip dan lisotip bagi isolat C. diphtheriae, teknik biologi molekul kini boleh digunakan untuk mengkaji wabak difteria. Corak penghadaman endonuclease sekatan DNA kromosom C. diphtheriae telah digunakan untuk mengkaji wabak klinikal, begitu juga dengan penggunaan urutan sisipan corynebacterial klon sebagai probe genetik.

Ujian Schick telah digunakan selama bertahun-tahun untuk menilai imuniti terhadap toksin difteria, walaupun kini telah digantikan di banyak kawasan dengan ujian serologi untuk antibodi khusus kepada toksin difteria. Dalam ujian Schick, sejumlah kecil toksin difteria (kira-kira 0.8 ng dalam 0.2 ml) disuntik secara intradermal ke dalam lengan bawah (tapak ujian) dan 0.0124 μg toksin difteria dalam 0.2 ml disuntik secara intradermal ke dalam tapak kawalan. Bacaan diambil pada 48 dan 96 jam. Reaksi kulit tidak spesifik biasanya memuncak pada 48 jam. Pada 96 jam, tindak balas erythematous dengan beberapa kemungkinan nekrosis di tapak ujian menunjukkan imuniti antitoksik yang tidak mencukupi untuk meneutralkan toksin (≤ 0.03 IU/ml). Keradangan di kedua-dua kawasan ujian dan kawalan selepas 48 jam menunjukkan tindak balas hipersensitiviti kepada penyediaan antigen.

Borang

Corynebacterium diphtheriae menjangkiti nasofaring atau kulit. Strain toksik menghasilkan eksotoksin kuat yang boleh menyebabkan difteria. Gejala difteria termasuk faringitis, demam, dan bengkak pada leher atau kawasan sekitar lesi kulit. Lesi difteri diliputi oleh pseudomembrane. Toksin merebak melalui aliran darah ke organ yang jauh dan boleh menyebabkan lumpuh dan kegagalan jantung kongestif. [ 6 ]

Terdapat dua jenis difteria klinikal: nasofaring dan kulit. Gejala difteria pharyngeal berkisar daripada faringitis ringan hingga hipoksia akibat halangan saluran udara oleh pseudomembrane. Penglibatan nodus limfa serviks boleh menyebabkan pembengkakan teruk pada leher (difteria leher lembu jantan), dan pesakit mungkin mengalami demam (≥ 103°F). Lesi kulit dalam difteria kulit biasanya dilitupi oleh pseudomembrane berwarna kelabu-coklat. Komplikasi sistemik yang mengancam nyawa, terutamanya kehilangan fungsi motor (cth, kesukaran menelan) dan kegagalan jantung kongestif, mungkin berlaku akibat tindakan toksin difteria pada neuron motor periferal dan miokardium.

Kawalan

Kawalan difteria bergantung kepada imunisasi yang mencukupi dengan toksoid difteria: toksin difteria dinyahaktifkan oleh formaldehid, yang kekal secara antigen utuh. Toksoid disediakan dengan mengeramkan toksin difteria dengan formaldehid pada suhu 37°C dalam keadaan beralkali. Imunisasi difteria harus bermula pada bulan kedua kehidupan dengan satu siri tiga dos utama pada selang 4 hingga 8 minggu, diikuti dengan dos keempat kira-kira 1 tahun selepas primer terakhir. Toksoid difteria digunakan secara meluas sebagai komponen vaksin difteria-pertussis-tetanus (DPT). Kajian epidemiologi telah menunjukkan bahawa imunisasi terhadap difteria adalah lebih kurang 97% berkesan. Walaupun imunisasi besar-besaran terhadap difteria diamalkan di Amerika Syarikat dan Eropah dan kadar imunisasi kanak-kanak adalah mencukupi, sebahagian besar populasi dewasa mungkin mempunyai titer antibodi di bawah paras perlindungan. Orang dewasa perlu divaksinasi semula dengan toksoid difteria setiap 10 tahun. Malah, imunisasi penggalak dengan toksoid difteria-tetanus harus diberikan kepada pelancong ke kawasan yang mempunyai kadar difteria endemik yang tinggi (Amerika Tengah dan Selatan, Afrika, Asia, Rusia, dan Eropah Timur). Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penggunaan persediaan toksoid yang sangat disucikan untuk imunisasi telah meminimumkan tindak balas hipersensitiviti yang teruk sekali-sekala. imunisasi penggalak dengan toksoid difteria-tetanus harus diberikan kepada pelancong ke kawasan yang mempunyai kadar difteria endemik yang tinggi (Amerika Tengah dan Selatan, Afrika, Asia, Rusia, dan Eropah Timur). Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penggunaan persediaan toksoid yang sangat disucikan untuk imunisasi telah meminimumkan tindak balas hipersensitiviti yang teruk sekali-sekala. Imunisasi booster dengan toksoid difteria-tetanus harus diberikan kepada pelancong ke kawasan yang mempunyai kadar difteria endemik yang tinggi (Amerika Tengah dan Selatan, Afrika, Asia, Rusia, dan Eropah Timur). Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, penggunaan persediaan toksoid yang sangat disucikan untuk imunisasi telah meminimumkan tindak balas hipersensitiviti yang teruk sekali-sekala.

Walaupun antibiotik (seperti penisilin dan eritromisin) digunakan sebagai sebahagian daripada rawatan pesakit difteria, imunisasi pasif pantas dengan antitoksin difteria adalah paling berkesan dalam mengurangkan kematian kes. Separuh hayat antitoksin spesifik yang panjang dalam aliran darah adalah faktor penting dalam memastikan peneutralan toksin difteria yang berkesan; Walau bagaimanapun, untuk menjadi berkesan, antitoksin mesti bertindak balas dengan toksin sebelum ia boleh memasuki sel.

Kejuruteraan semula toksin difteria untuk pembangunan sitotoksin khusus reseptor eukariotik

Kejuruteraan protein ialah bidang baharu dan pesat membangun dalam biologi molekul; ia menggabungkan metodologi DNA rekombinan dan sintesis DNA fasa pepejal untuk mereka bentuk dan membina gen chimeric yang produknya mempunyai sifat unik. Kajian tentang hubungan struktur-fungsi toksin difteria telah menunjukkan dengan jelas bahawa toksin ini ialah protein tiga domain: pemangkin, transmembran, dan reseptor. Adalah mungkin untuk menggantikan domain toksin difteria yang mengikat reseptor asli dengan pelbagai hormon polipeptida dan sitokin (cth, hormon perangsang α-melanocyte [α-MSH], interleukin (IL) 2, IL-4, IL-6, IL-7, faktor pertumbuhan epidermis). Protein chimeric atau toksin gabungan yang terhasil menggabungkan kekhususan pengikat reseptor sitokin dengan domain transmembran dan pemangkin toksin. Dalam setiap kes, toksin gabungan ditunjukkan untuk meracuni secara selektif hanya sel-sel yang menanggung reseptor sasaran yang sepadan. Toksin gabungan yang diubah suai secara genetik yang pertama ini, DAB 389IL-2, kini sedang dinilai dalam ujian klinikal manusia untuk rawatan limfoma refraktori dan penyakit autoimun di mana sel-sel dengan reseptor IL-2 mempunyai pertalian tinggi memainkan peranan penting dalam patogenesis.[ 7 ] Pentadbiran DAB 389 IL-2 telah ditunjukkan sebagai penyakit yang selamat, tahan lama dan boleh diterima semula dengan baik. Kemungkinan toksin gabungan berasaskan toksin difteria akan menjadi agen biologi baharu yang penting untuk rawatan tumor atau penyakit tertentu di mana reseptor permukaan sel tertentu boleh disasarkan.