Sel stem hematopoietik daripada darah tali pusat

Darah tali pusat adalah sumber sel stem hematopoietik yang baik dari segi potensi proliferatif dan keupayaan repopulasi sel hematopoietik. Telah berulang kali ditunjukkan bahawa pada masa kelahiran, darah tali pusat mengandungi sejumlah besar sel progenitor hematopoietik yang lemah. Sesetengah penulis percaya bahawa kelebihan pemindahan sel stem hematopoietik darah tali pusat adalah kekurangan keperluan untuk mencari penderma yang serasi dengan antigen HLA. Pada pendapat mereka, ketidakmatangan sistem imun bayi baru lahir menyebabkan aktiviti fungsi sel imunokompeten berkurangan dan, dengan itu, insiden penyakit rasuah berbanding perumah yang teruk berbanding dengan pemindahan sumsum tulang. Pada masa yang sama, kadar kelangsungan hidup pemindahan sel darah tali pusat tidak lebih rendah daripada sel sumsum tulang, walaupun dalam kes menggunakan bilangan HSC yang lebih kecil yang diberikan setiap 1 kg berat badan pesakit. Walau bagaimanapun, pada pendapat kami, isu bilangan optimum sel darah kord yang dipindahkan yang diperlukan untuk pengukuhan berkesan dalam badan penerima, keserasian imunologi mereka, dan beberapa aspek lain dalam masalah pemindahan sel stem hematopoietik darah tali pusat memerlukan analisis yang lebih serius.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]

Mendapatkan sel stem hematopoietik daripada darah tali pusat

Prosedur untuk mendapatkan sel stem hematopoietik daripada darah tali pusat memerlukan pengumpulannya sejurus selepas kelahiran kanak-kanak dan pemisahannya daripada plasenta apabila plasenta berada dalam utero atau ex utero, serta semasa pembedahan cesarean, tetapi juga ex utero. Telah ditunjukkan bahawa jika masa dari saat kelahiran hingga pemisahan bayi yang baru lahir dari plasenta dikurangkan kepada 30 saat, jumlah darah tali pusat yang diperoleh meningkat dengan purata 25-40 ml. Jika prosedur ini dilakukan kemudian, jumlah darah yang sama akan hilang. Telah ditetapkan bahawa pemisahan awal kanak-kanak dari plasenta tidak memerlukan sebarang akibat negatif untuk bayi yang baru lahir.

Institut Penyelidikan Hematologi dan Transfusiologi Rusia telah membangunkan teknologi yang berkesan dan kos rendah untuk mendapatkan darah tali pusat semasa kelahiran normal ((70.2+25.8) ml) dan pembedahan cesarean ((73.4+25.1) ml). Kaedah untuk mengasingkan darah tali pusat dengan hasil sel bernuklear dan mononuklear yang cukup tinggi telah dicadangkan - (83.1+9.6) dan (83.4+14.1)%, masing-masing. Kaedah untuk pengawetan kriopemeliharaan darah tali pusat telah dipertingkatkan, yang memastikan pemeliharaan tinggi sel mononuklear dan CFU-GM - (96.8+5.7) dan (89.6+22.6)%, masing-masing. Kecekapan kaedah saliran untuk mengumpul darah tali pusat menggunakan bekas Kompoplast-300 (Rusia) telah ditentukan. Penulis mengumpul darah tali pusat sejurus selepas kelahiran kanak-kanak dan pemisahannya dari plasenta, dalam keadaan penempatan plasenta dalam utero atau ex utero. Sebelum tusukan vena pusat, tali pusat dirawat sekali dengan tincture iodin 5%, dan kemudian dua kali dengan 70% etil alkohol. Darah mengalir secara spontan melalui tiub penyambung ke dalam bekas. Prosedur pengumpulan mengambil masa tidak lebih daripada 10 minit. Purata isipadu 66 sampel darah tali pusat yang dikumpul melalui saliran ialah (72+28) ml, dan bilangan leukosit dalam purata jumlah volum sampel ialah (1.1+0.6) x 107. Apabila menganalisis darah tali pusat untuk kemandulan (pencemaran bakteria, HIV-1, virus hepatitis B dan C, sifilis dan satu sampel virus hepatitis Cgalos yang dikesan), sifilis dan virus hepatitis Cgalovirus yang dikesan. Dalam kajian lain, plasenta diletakkan permukaan janin ke bawah pada bingkai khas sejurus selepas kelahiran, tali pusat dirawat dengan larutan iodin 5% dan 75% etil alkohol. Urat pusat disalirkan menggunakan jarum dari sistem transfusi (G16). Darah mengalir ke dalam bekas secara spontan. Purata isipadu darah yang dikumpul dengan cara ini ialah (55+25) ml. Dalam karya G. Kogler et al. (1996), darah tali pusat dikumpulkan menggunakan kaedah tertutup dan jumlah darah yang besar diperolehi - secara purata (79+26) ml. Penulis ambil perhatian bahawa antara 574 sampel darah tali pusat, kira-kira 7% mengandungi kurang daripada 40 ml darah, yang tidak membenarkan mereka digunakan untuk pemindahan. K. Isoyama et al. (1996), mengumpul darah tali pusat melalui pembuangan aktif menggunakan picagari, memperoleh purata 69.1 ml darah (isipadu darah tali pusat berbeza dari 15 hingga 135 ml). Akhirnya, A. Abdel-Mageed PI et al. (1997) berjaya memperoleh purata 94 ml darah tali pusat (dari 56 hingga 143 ml) melalui kateterisasi vena pusat.

Untuk mengurangkan risiko jangkitan iatrogenik dan pencemaran dengan rembesan ibu, sistem pengumpulan darah tertutup telah dibangunkan berdasarkan sistem transfusi Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL (USA) yang digunakan secara meluas, yang mengandungi 62.5 ml CPDA (citrate-phosphate-dextrose with adenine) sebagai antikoagulan. Teknologi untuk mendapatkan bahan adalah kepentingan utama untuk menyediakan sampel berkualiti tinggi dari segi isipadu, kandungan dan ketulenan ampaian sel. Daripada kaedah sedia ada untuk mengumpul darah tali pusat, yang secara konvensional dikelaskan kepada sistem tertutup, separa terbuka dan terbuka, keutamaan harus diberikan kepada yang pertama, kerana sistem tertutup dengan ketara mengurangkan risiko pencemaran mikrob bahan, serta pencemaran penggantungan sel dengan sel ibu.

A. Nagler et al. (1998) menjalankan analisis perbandingan kecekapan ketiga-tiga sistem untuk mengumpul darah tali pusat. Dalam varian pertama, prosedur itu dijalankan dalam sistem tertutup dengan mengelupas darah terus ke dalam bekas. Dalam varian kedua, darah tali pusat diperoleh melalui pengeluaran darah aktif dengan picagari MP1 diikuti dengan pembilasan vena plasenta dan pengaliran darah serentak ke dalam bekas (kaedah terbuka). Dalam varian ketiga, darah dikumpul dalam sistem separa terbuka dengan mengekstraknya secara aktif dengan picagari dan menyiramnya melalui arteri umbilical dengan pelepasan serentak ke dalam bekas. Dalam varian pertama, penulis memperoleh darah tali pusat dalam jumlah (76.4+32.1) ml dengan kandungan leukosit (10.5+3.6) x 10 ⁶ dalam 1 ml darah. Dalam varian kedua, penunjuk yang sepadan ialah (174.4+42.8) ml dan (8.8+3.4) x 10 ⁶ /ml; dalam ketiga - (173.7+41.3) ml dan (9.3+3.8) x 10 ⁶ /ml. Jangkitan sampel darah tali pusat yang paling kerap diperhatikan apabila menggunakan sistem terbuka. Korelasi langsung telah ditubuhkan antara jisim plasenta dan jumlah darah yang diekstrak - dengan peningkatan jisim plasenta, jumlah darah yang dikumpul meningkat.

Selepas pengumpulan darah tali pusat, peringkat pemisahan berikut - pengasingan sel mononuklear dan penulenan penggantungan sel daripada eritrosit. Dalam keadaan eksperimen, sel bernukleus diasingkan melalui pemendapan dengan metilselulosa semasa lisis eritrosit dengan ammonium klorida. Walau bagaimanapun, metilselulosa tidak boleh digunakan untuk tujuan klinikal, kerana kehilangan sel stem hematopoietik di atasnya mencapai 50-90%. Lisis eritrosit juga hampir tidak pernah dilakukan di klinik kerana jumlah besar penyelesaian yang berfungsi, walaupun peratusan pengasingan sel bernukleus dengan fenotip CD34+, serta sel progenitor dengan fungsi CFU-GM dan CFU-GEMM dengan cara ini jauh lebih tinggi. Kemunculan cara baru untuk mengasingkan sel mononuklear dalam kecerunan ketumpatan, larutan ketumpatan buyant (BDS72), dilaporkan. Bahan ini mempunyai parameter fisiologi berikut: pH - 7.4, osmolaliti - 280 mOsm/kg, ketumpatan - 1.0720 g/ml. Menurut penulis, ia boleh digunakan untuk mengasingkan sehingga 100% sel positif CD34 dan mengeluarkan 98% eritrosit. Walau bagaimanapun, BDS72 masih belum digunakan di klinik.

Dalam kaedah yang diluluskan untuk mengasingkan sel bernukleus daripada darah tali pusat, larutan kanji hidroksietil 10% atau larutan gelatin 3% biasanya digunakan. Kecekapan pemendapan eritrosit dan pengasingan sel bernukleus dalam kedua-dua kes adalah lebih kurang sama. Walau bagaimanapun, apabila gelatin digunakan sebagai agen pemendapan, adalah mungkin untuk memperoleh jumlah CFU-GM yang sedikit lebih besar daripada apabila menggunakan kanji hidroksietil. Diandaikan bahawa perbezaan dalam kecekapan pengasingan CFU-GM adalah disebabkan oleh kadar pemendapan yang berbeza bagi pecahan individu sel bernukleus atau keupayaan molekul kanji hidroksietil untuk diserap pada permukaan reseptor sel hematopoietik dan dengan itu menyekat kepekaan mereka terhadap faktor perangsang koloni yang digunakan dalam pengkulturan CFU-GM secara in vitro. Walau bagaimanapun, kedua-dua sedimentator mungkin sesuai untuk mengasingkan sel bernukleus apabila mencipta bank darah tali pusat berskala besar.

Kaedah pemisahan darah tali pusat dan cryopreservation pada asasnya tidak berbeza daripada yang digunakan dalam kerja dengan sel stem hematopoietik darah periferi dan sumsum tulang penderma dewasa. Tetapi apabila menyediakan sejumlah besar sampel darah tali pusat untuk banknya, kaedah pengasingan mestilah, pertama sekali, kos rendah. Oleh itu, malangnya, pada masa ini, untuk keperluan klinikal, kaedah rutin yang telah diuji untuk mengasingkan dan mengawetkan sel darah tali pusat digunakan, dan kaedah yang lebih berkesan, tetapi mahal tetap menjadi banyak penguji.

Secara umum, kriteria untuk menilai bilangan sel hematopoietik dan keperluan untuk memeriksa sampel darah tali pusat bagi mengenal pasti agen berjangkit telah diluluskan. Untuk memastikan keselamatan pemindahan sel hematopoietik darah tali pusat, semua sampel darah mesti diperiksa terutamanya untuk jangkitan hematogen dan penyakit genetik. Sebilangan pengarang mengesyorkan kaedah khas tambahan untuk memeriksa darah tali pusat untuk mendiagnosis penyakit genetik seperti a-talasemia, anemia sel sabit, kekurangan adenosin deaminase, agammaglobulinemia Bruton, penyakit Hurler dan Ponter.

Menurut cadangan L. Ticheli dan pengarang bersama (1998), setiap sampel darah tali pusat mesti diuji untuk sel bernukleus, sel CD34-positif, dan CFU-GM, penaipan HLA mesti dilakukan, dan kumpulan darah mesti ditentukan mengikut ABO dan faktor Rhnya. Di samping itu, kultur bakteriologi, ujian serologi untuk HIV dan jangkitan sitomegalovirus, HBsAg, virus hepatitis C, HTLY-I dan HTLV-II (leukemia sel T manusia), sifilis, dan toksoplasmosis mesti dilakukan. Tindak balas rantai polimerase untuk sitomegalovirus dan jangkitan HIV adalah wajib.

Prosedur untuk mendapatkan darah tali pusat mesti dijalankan mengikut ketat dengan prinsip bioetika perubatan. Sebelum pengambilan darah, perlu mendapatkan persetujuan wanita hamil untuk menjalankannya. Perbualan awal dengan wanita hamil untuk mendapatkan persetujuan termaklum untuk semua manipulasi, dari perkumuhan darah hingga mengisi dokumentasi, hanya dilakukan oleh pekerja perubatan. Dalam apa jua keadaan, mana-mana prosedur ini tidak dibenarkan untuk dijalankan oleh kakitangan dengan pendidikan biologi, kimia, farmaseutikal atau lain-lain bukan perubatan, kerana pelanggaran norma bioetika dan hak asasi manusia yang ditetapkan. Sekiranya ujian positif untuk pengangkutan HBsAg, kehadiran antibodi kepada patogen hepatitis C, jangkitan HIV dan sifilis, darah tali pusat tidak dikumpulkan, dan sampel darah yang telah dikumpulkan ditolak dan dimusnahkan. Perlu diingatkan bahawa pembawa jangkitan laten pada bayi baru lahir adalah kurang biasa daripada pada orang dewasa, oleh itu, kebarangkalian pemindahan hematogen dan perkembangan komplikasi berjangkit semasa penyerapan sel hematopoietik darah tali pusat adalah jauh lebih rendah daripada dalam kes menggunakan sumsum tulang penderma dewasa untuk pemindahan.

Aspek penting penggunaan klinikal darah tali pusat ialah penilaian pemindahan, yang berdasarkan penentuan jumlah sel stem hematopoietik dalam sampel darah tali pusat dan dos sel yang diperlukan untuk pemindahan. Pada masa ini, piawaian untuk jumlah optimum sel darah tali pusat yang diperlukan untuk pemindahan masih belum dibangunkan. Tiada sudut pandangan yang diterima umum walaupun pada parameter rutin seperti bilangan sel CD34-positif dan CFU-GM. Sesetengah pengarang menilai potensi sel hematopoietik dengan menganalisis kultur jangka panjang dengan penentuan kandungan unit pembentuk koloni yang biasa kepada granulosit, eritrosit, monosit dan megakaryosit - CFU-GEMM.

Walau bagaimanapun, dalam keadaan klinikal, penilaian standard pemindahan darah tali pusat biasanya hanya melibatkan penentuan bilangan sel bernuklear atau mononuklear.

Penyimpanan sel stem hematopoietik darah tali pusat

Terdapat juga beberapa masalah dalam teknologi menyimpan sel hematopoietik darah tali pusat. Apabila memulihara sel stem hematopoietik, untuk mencapai mod pembekuan optimum, adalah perlu untuk mengurangkan jumlah darah tali pusat sebanyak mungkin, dan juga untuk mengeluarkan eritrosit terlebih dahulu untuk mengelakkan hemolisis dan risiko mengembangkan tindak balas ketidakserasian untuk antigen eritrosit (ABO, Rh). Pelbagai kaedah mengasingkan sel bernukleus sesuai untuk tujuan ini. Pada awal 90-an abad yang lalu, kaedah yang paling banyak digunakan ialah mengasingkan sel bernukleus dalam kecerunan ketumpatan berdasarkan Ficoll dengan ketumpatan 1.077 g / ml atau Percoll dengan ketumpatan 1.080 g / ml. Pemisahan darah tali pusat dalam kecerunan ketumpatan membolehkan pengasingan kebanyakannya sel mononuklear, tetapi membawa kepada kehilangan ketara sel progenitor hematopoietik - sehingga 30-50%.

Kecekapan pemendapan kanji hidroksietil dalam proses pengasingan sel hematopoietik darah tali pusat dinilai secara berbeza. Sesetengah pengarang menunjukkan kualiti pemisahan yang rendah menggunakan kaedah ini, manakala penyelidik lain, sebaliknya, di antara semua kaedah yang mungkin, memberi keutamaan kepada mengasingkan darah tali pusat HSC menggunakan larutan kanji hidroksietil 6%. Pada masa yang sama, kecekapan tinggi pemendapan sel hematopoietik ditekankan, yang, menurut beberapa data, mencapai dari 84% hingga 90%.

Penyokong sudut pandangan yang berbeza percaya bahawa hampir semua kaedah pecahan dikaitkan dengan kehilangan besar sel bernukleus dan mencadangkan untuk melakukan pengasingan dengan sentrifugasi, membahagikan darah tali pusat kepada 3 pecahan: eritrosit, cincin leukosit dan plasma. Dengan mengasingkan sel dengan cara ini, penulis mendapati bahawa kandungan sel mononuklear, sel progenitor hematopoietik awal dan sel dengan immunophenotype CD34+ akhirnya masing-masing berjumlah 90, 88 dan 100% daripada tahap awal. Nilai yang sama untuk peningkatan sel darah tali pusat yang disucikan dengan kaedah ini juga diperoleh oleh penyelidik lain: selepas pemendapan, 92% sel bernuklear, 98% sel mononuklear, 96% sel positif CD34 dan 106% unit pembentuk koloni telah diasingkan.

Pada akhir 1990-an, gelatin digunakan secara meluas sebagai agen pemendapan. Dalam amalan klinikal, gelatin telah digunakan untuk mengasingkan sel stem hematopoietik daripada darah tali pusat sejak 1994. Apabila menggunakan larutan gelatin 3%, kecekapan mengasingkan sel bernukleus mencapai 88-94%. Penggunaan gelatin secara besar-besaran dalam mencipta tabung darah tali pusat telah mengesahkan kelebihannya berbanding agen pemendapan lain. Analisis perbandingan kecekapan semua kaedah di atas untuk mengasingkan sel bernuklear di bawah syarat penggunaan berurutan pada setiap sampel darah tali pusat yang diuji telah membuktikan bahawa larutan gelatin 3% adalah agen pemendapan yang optimum dari segi hasil sel mononuklear dengan fenotip CD34+/CD45+, dan juga dari segi CFUGE-MMGM, serta dari segi CFUGE-MMGM. Kaedah menggunakan kecerunan ketumpatan Ficoll, serta penggunaan kanji hidroksietil dan metilselulosa, adalah kurang berkesan, dengan kehilangan sel hematopoietik mencapai 60%.

Pengembangan jumlah pemindahan sel stem darah tali pusat dikaitkan bukan sahaja dengan pembangunan kaedah untuk pemerolehan mereka, tetapi juga penyimpanan. Terdapat banyak masalah yang berkaitan secara langsung dengan penyediaan darah tali pusat untuk penyimpanan jangka panjang dan pilihan teknologi optimum untuk pengawetan kripto sampelnya. Antaranya ialah isu kebolehlaksanaan menjalankan prosedur pengasingan, menggunakan pelbagai media pengawetan krio dan menggunakan kaedah untuk menyediakan sel yang dinyahbeku untuk pemindahan. Pengangkutan sampel darah tali pusat selalunya dilakukan dari kawasan yang jauh dari pusat hematologi. Dalam hal ini, masalah tempoh penyimpanan yang boleh diterima untuk darah tali pusat dari saat pemerolehannya hingga permulaan cryopreservation timbul, yang sangat penting apabila membuat bank darah tali pusat.

Kajian mengenai aktiviti fungsi sel hematopoietik dalam darah tali pusat selepas penyimpanan jangka panjang (sehingga 12 tahun) dalam nitrogen cecair telah menunjukkan bahawa kira-kira 95% sel hematopoietik tidak kehilangan kapasiti proliferatif yang tinggi dalam tempoh ini. Dalam kerja S. Yurasov dan pengarang bersama (1997), telah terbukti bahawa menyimpan darah tali pusat pada suhu bilik (22°C) atau pada 4°C selama 24 dan 48 jam tidak ketara mengurangkan daya maju sel hematopoietik, iaitu 92 dan 88% daripada tahap awal, masing-masing. Walau bagaimanapun, jika tempoh penyimpanan dilanjutkan kepada tiga hari, bilangan sel nukleus yang berdaya maju dalam darah tali pusat berkurangan dengan ketara. Pada masa yang sama, kajian lain telah menunjukkan bahawa apabila disimpan selama 2-3 hari pada suhu 22 atau 4°C, daya maju granulosit matang, dan bukannya sel hematopoietik, menderita pertama sekali.

Daya maju sel stem hematopoietik darah tali pusat mungkin terjejas secara negatif oleh komponen sistem pengumpulan darah tali pusat. Analisis kesan pelbagai antikoagulan yang mekanisme tindakannya disebabkan oleh pengikatan ion kalsium (ACD, EDTA, XAPD-1) pada sel progenitor hematopoietik dalam keadaan penyimpanan darah tali pusat selama 24 hingga 72 jam mendedahkan kesan negatifnya terhadap daya maju sel bernukleus. Dalam hal ini, penulis mengesyorkan menggunakan PBS (penyelesaian penampan fosfat) dengan penambahan heparin asli tanpa pengawet pada kepekatan 20 U/ml, yang, pada pendapat mereka, membolehkan meningkatkan tempoh penyimpanan darah tali pusat yang tidak terpecah kepada 72 jam dan mengekalkan aktiviti fungsi unit pembentuk koloni. Walau bagaimanapun, kajian keselamatan CFU-GM dan CFU-G menunjukkan bahawa masa penyimpanan darah tali pusat sebelum cryopreservation tidak boleh melebihi sembilan jam. Jelas sekali, prinsip yang harus digunakan dalam kes ini ialah dengan adanya data yang bercanggah, tempoh penyimpanan minimum yang disyorkan untuk darah tali pusat harus digunakan dan pembekuan terprogram bagi sel terpencil harus dimulakan secepat mungkin.

Apabila membekukan sel stem hematopoietik darah tali pusat, larutan DMSO 10% biasanya digunakan sebagai cryoprotectant. Walau bagaimanapun, sebagai tambahan kepada kesan krioprotektif yang jelas, dimetil sulfoksida dalam kepekatan sedemikian juga mempunyai kesan sitotoksik langsung, walaupun dengan pendedahan minimum kepada sel hematopoietik darah tali pusat. Untuk mengurangkan kesan sitotoksik DMSO, suhu pendedahan sifar digunakan, kelajuan semua manipulasi ditingkatkan, dan pencucian berganda dilakukan selepas mencairkan sampel darah tali pusat.

Sejak tahun 1995, Institut Hematologi dan Transfusiologi Akademi Sains Perubatan Ukraine telah membangunkan hala tuju saintifik yang bertujuan untuk kajian komprehensif darah tali pusat sebagai sumber alternatif sel stem hematopoietik. Khususnya, teknologi baharu untuk pengawetan suhu rendah sel hematopoietik darah tali pusat yang tidak terpecah dan terpecah telah dibangunkan. Polyvinylpyrrolidone perubatan molekul rendah digunakan sebagai cryoprotectant. Kaedah cryopreservation darah tali pusat yang tidak terpecah adalah berdasarkan teknologi asal untuk pra-penyediaan sel untuk pembekuan dan kaedah untuk pemprosesan khas penggantungan sel sejurus sebelum pemindahan.

Salah satu faktor terpenting yang mempengaruhi tahap aktiviti kefungsian sel stem hematopoietik terpelihara ialah kadar penyejukan ampaian sel, terutamanya semasa fasa penghabluran. Pendekatan perisian untuk menyelesaikan masalah kelajuan dan masa pembekuan menyediakan peluang besar untuk mencipta kaedah pengawetan krio yang mudah dan sangat berkesan, tanpa membasuh penggantungan sel daripada cryoprotectors sebelum pemindahan.

Peringkat yang paling berbahaya untuk daya maju sel semasa penyediaannya ialah peringkat pembekuan dan pencairan langsung. Apabila membekukan sel hematopoietik, sebahagian besar daripada mereka boleh dimusnahkan pada saat peralihan medium antara sel daripada cecair ke fasa pepejal - penghabluran. Untuk mengurangkan peratusan kematian sel, cryoprotectors digunakan, mekanisme tindakan dan kecekapan krioprotektif yang cukup diliputi dalam kesusasteraan saintifik.

Arah yang menjanjikan untuk mengoptimumkan kaedah cryopreservation untuk sumsum tulang dan sel darah tali pusat ialah gabungan kepekatan rendah beberapa cryoprotectors dengan mekanisme tindakan yang berbeza dalam satu penyelesaian, contohnya, DMSO bertindak pada tahap intraselular dan kanji hidroksietil atau albumin, yang mempunyai kesan perlindungan ekstraselular.

Untuk pengawetan krio sel darah tali pusat, larutan DMSO 20% digunakan secara tradisional, yang dituangkan perlahan-lahan ke dalam ampaian sel dengan kacau mekanikal berterusan dalam mandi ais sehingga nisbah (1:1) yang sama bagi isipadu krioproteksi dan ampaian sel dicapai. Kepekatan akhir dimetil sulfoksida ialah 10%. Suspensi sel kemudiannya disejukkan dalam unit kriogenik yang diprogramkan pada kadar GS/min hingga -40°C, selepas itu kadar penyejukan ditingkatkan kepada 10°C/min. Selepas mencapai -100°C, bekas dengan ampaian sel diletakkan dalam nitrogen cecair (-196°C). Dengan teknik cryopreservation ini, pemeliharaan sel mononuklear yang berfungsi secara aktif selepas penyahbekuan mencapai 85% daripada tahap asal.

Pengubahsuaian kaedah cryopreservation bertujuan untuk mengurangkan kepekatan DMSO dengan menambahkan kanji hidroksietil (kepekatan akhir dimetil sulfoksida dan kanji hidroksietil adalah 5 dan 6%, masing-masing). Kecekapan tinggi gabungan cryoprotectors sedemikian diperhatikan apabila membekukan penggantungan sel myeloid, dan dengan sitoproteksi tidak kurang daripada apabila menggunakan hanya larutan 10% dimetil sulfoksida. Bilangan sel nukleus yang berdaya maju mencapai 96.7% daripada tahap awal, dan aktiviti fungsinya, dianggarkan oleh bilangan CFU-GM, ialah 81.8%.

Apabila menggunakan larutan dimetil sulfoksida dalam kepekatan dari 5 hingga 10% dalam kombinasi dengan 4% kanji hidroksietil (kepekatan akhir), didapati bahawa keselamatan sel CD34-positif dalam julat dimetil sulfoksida sedemikian kekal hampir tidak berubah. Pada masa yang sama, apabila kepekatan dimetil sulfoksida berkurangan daripada 5 hingga 2.5%, kematian besar-besaran sel darah tali pusat diperhatikan - bilangan unit sel yang berdaya maju berkurangan daripada 85.4 hingga 12.2%. Penulis lain juga membuat kesimpulan bahawa ia adalah 5 dan 10% penyelesaian dimetil sulfoksida (dalam versi penulis - dalam kombinasi dengan serum autologous) yang memberikan cytoprotection dengan kecekapan maksimum semasa cryopreservation HSC darah tali pusat. Di samping itu, pemeliharaan tinggi sel beku dan cair berturut-turut dicatatkan dalam kes gabungan 5 atau 10% dimetil sulfoksida dengan larutan kanji hidroksietil 4%, terutamanya pada kadar penyejukan terkawal GS/min. Dalam kajian lain, penyelesaian krioprotektif digunakan yang terdiri daripada tiga bahan - DMSO, albumin manusia yang telah dimurnikan dan medium RPMI dalam nisbah 1:4:5, yang ditambah kepada penggantungan sel kepada nisbah isipadu yang sama (kepekatan akhir dimetil sulfoksida ialah 5%). Selepas penyahbekuan dalam mandi air pada suhu +4 GS, pemeliharaan CFU-GM melebihi 94%.

Sesetengah pengarang mencadangkan menggunakan darah tali pusat tanpa pecahan untuk pengawetan krio, kerana sejumlah besar sel hematopoietik hilang semasa proses penyingkiran sel darah merah. Dalam varian ini, larutan 10% dimetil sulfoksida digunakan untuk melindungi sel mononuklear daripada kesan merosakkan krikristalisasi. Pembekuan dilakukan pada kadar penyejukan berterusan GS/min hingga -80°C, selepas itu penggantungan sel darah tali pusat diturunkan kepada nitrogen cecair. Kaedah pembekuan ini mengakibatkan lisis separa sel darah merah, jadi sampel darah tidak memerlukan pecahan. Selepas penyahbekuan, penggantungan sel dibasuh daripada hemoglobin bebas dan dimetil sulfoksida dalam larutan albumin manusia atau dalam serum darah autologus pesakit dan digunakan untuk pemindahan.

Pemeliharaan sel progenitor hematopoietik selepas pencairan darah tali pusat yang tidak dipecahkan sememangnya lebih tinggi daripada darah tali pusat yang difraksinasi, namun, disebabkan kestabilan kriosit sesetengah eritrosit, masalah pasca pemindahan yang serius mungkin timbul akibat pemindahan eritrosit yang tidak serasi dengan ABO. Di samping itu, jumlah darah tidak terpecah yang disimpan meningkat dengan ketara. Dari sudut pandangan klinikal, pengawetan krio yang telah diasingkan dan disucikan sebelum ini daripada pecahan sel lain sel hematopoietik darah tali pusat masih lebih baik.

Khususnya, kaedah untuk pengawetan krio sel darah tali pusat pecahan telah dibangunkan, membolehkan penyingkiran eritrosit pada peringkat penyediaan untuk pembekuan, di mana larutan 6% kanji hidroksietil digunakan sebagai sebahagian daripada larutan pengganti plasma "Stabizol". Selepas penyahbekuan, penggantungan sel yang diperoleh dengan cara ini sedia untuk kegunaan klinikal tanpa manipulasi tambahan.

Oleh itu, pada masa ini terdapat banyak kaedah cryopreservation darah tali pusat yang agak berkesan. Perbezaan asasnya ialah sampel darah dibekukan tanpa pecahan atau tertakluk kepada pemisahan kepada pecahan sel pada peringkat penyediaan dan sel bernukleus tanpa campuran eritrosit disediakan.

Pemindahan sel stem hematopoietik darah tali pusat

Pada akhir 1980-an dan awal 1990-an, telah ditubuhkan bahawa darah tali pusat, yang memberikan janin dengan sokongan hidup semasa kehamilan, mempunyai kandungan sel stem hematopoietik yang tinggi. Kesederhanaan relatif untuk mendapatkan sel darah tali pusat dan ketiadaan masalah etika yang jelas menyumbang kepada penggunaan sel stem darah tali pusat dalam perubatan praktikal. Pemindahan darah tali pusat pertama yang berjaya kepada kanak-kanak dengan anemia Fanconi berfungsi sebagai titik permulaan untuk mengembangkan jumlah pemindahan sel stem darah tali pusat dan mewujudkan sistem untuk perbankannya. Dalam sistem bank darah tali pusat dunia, yang terbesar ialah Pusat Darah Plasenta New York, yang terdapat pada kunci kira-kira Institut Kesihatan Nasional AS. Jumlah sampel darah tali pusat yang disimpan di bank ini menghampiri 20,000. Bilangan penerima (kebanyakannya kanak-kanak) yang telah menjalani pemindahan yang berjaya juga semakin meningkat. Menurut Jabatan Kesihatan AS, tempoh bebas berulang bagi hayat pasca pemindahan penerima pemindahan darah tali pusat sudah melebihi 10 tahun.

Ini tidak menghairankan, kerana banyak kajian tentang potensi hematopoietik darah tali pusat telah menunjukkan bahawa dari segi kuantiti dan kualiti sel stem terawal, ia bukan sahaja tidak lebih rendah daripada sumsum tulang orang dewasa, tetapi juga melebihinya dalam beberapa aspek. Potensi proliferatif sel stem darah tali pusat yang lebih tinggi adalah disebabkan oleh ciri ontogenetik isyarat selular, kehadiran reseptor untuk faktor pertumbuhan tertentu pada HSC, keupayaan sel darah tali pusat untuk pengeluaran faktor pertumbuhan autokrin, dan saiz dan panjang telomer yang besar.

Oleh itu, ciri genomik dan fenotip sel stem hematopoietik darah tali pusat menentukan penggabungan pemindahan yang berkualiti tinggi dengan potensi tinggi untuk pemulihan hematopoiesis penderma dalam badan penerima.

Faedah sel stem hematopoietik darah tali pusat

Antara kelebihan sebenar menggunakan sel stem hematopoietik darah tali pusat untuk pemindahan berbanding sumber sel hematopoietik yang lain, adalah wajar diperhatikan risiko hampir sifar kepada kesihatan penderma (jika kita tidak menganggap plasenta seperti itu) dan ketiadaan keperluan untuk anestesia am. Penggunaan darah tali pusat meluaskan kemungkinan pemindahan sel disebabkan pemindahan sebahagiannya serasi HLA (ketidakserasian daripada satu hingga tiga antigen). Kaedah untuk penyimpanan jangka panjang sel hematopoietik darah tali pusat dalam keadaan beku telah dibangunkan, yang meningkatkan kemungkinan mendapatkan jenis HLA yang jarang ditemui dan mengurangkan masa untuk mencari pemindahan yang serasi dengan HLA untuk pemindahan alogenik. Pada masa yang sama, risiko untuk membangunkan jangkitan terpendam tertentu yang dihantar melalui cara yang boleh ditularkan dikurangkan dengan ketara. Di samping itu, bentuk insurans hayat biologi yang murah timbul kerana kemungkinan menggunakan sel darah tali pusat untuk pemindahan autologus.

Walau bagaimanapun, disebabkan oleh jumlah darah yang kecil yang boleh dikumpulkan dari plasenta (secara purata tidak lebih daripada 100 ml), masalah mendapatkan jumlah maksimum darah yang mungkin dari urat tali pusat menjadi perhatian sambil memerhatikan keadaan risiko minimum pencemaran bakteria dari sampel darah tali pusat yang diperolehi.

Sel hematopoietik primitif darah tali pusat biasanya dikenal pasti dengan kehadiran glikofosfoprotein CD34 pada permukaannya, serta berdasarkan sifat fungsinya dengan mengkaji klonogenisiti atau pembentukan koloni secara in vitro. Analisis perbandingan menunjukkan bahawa dalam darah tali pusat dan sumsum tulang kandungan maksimum sel CD34-positif dalam pecahan mononuklear ialah 1.6 dan 5.0%, masing-masing, tahap maksimum unit pembentuk koloni dalam subpopulasi sel CD34+ ialah 80 dan 25%, jumlah kecekapan pengklonan sel CD34+ maksimum ialah 88, dan 58% kandungan potensi pembiakan maksimum sel koloni. (HPP-CFC dalam populasi CD34+) ialah 50 dan 6.5%. Perlu ditambah bahawa kecekapan pengklonan sel CD34+CD38 dan keupayaan untuk bertindak balas terhadap rangsangan sitokin juga lebih tinggi dalam sel stem hematopoietik darah tali pusat.

Gabungan antigen fenotip Thy-1, CD34 dan CD45RA mengesahkan potensi proliferatif tinggi sel hematopoietik darah tali pusat, dan ekspresi ketiga-tiga antigen ini pada permukaan sel darah tali pusat menunjukkan kepunyaan mereka dalam sel stem. Di samping itu, didapati bahawa darah tali pusat mengandungi sel dengan fenotip CD34+ yang tidak mempunyai penanda pembezaan linear. Tahap subpopulasi selular dengan profil fenotip CD34+/Lin dalam darah tali pusat adalah kira-kira 1% daripada jumlah sel CD34-positif. Sel-sel progenitor hematopoietik darah tali pusat menimbulkan kedua-dua garisan sel limfoid dan siri myeloid pluripotent pembezaan sel linear, yang juga menunjukkan kepunyaan mereka dalam sel stem.

Seperti yang telah disebutkan, perbezaan ketara antara sumsum tulang dan darah tali pusat adalah dalam jumlah sel hematopoietik yang digunakan untuk pemindahan yang diperolehi semasa satu prosedur pengumpulan. Jika semasa pemindahan sumsum tulang kehilangan jisim sel semasa pemisahan, pengawetan krio, pencairan dan ujian boleh diterima dalam 40-50%, maka bagi darah tali pusat kehilangan sel sedemikian adalah sangat ketara, kerana jika jumlah HSC yang tidak mencukupi digunakan, pemindahan mungkin terbukti tidak berkesan. Menurut G. Kogler et al. (1998), untuk pemindahan sel dengan berat badan penerima 10 kg, semua sampel darah tali pusat boleh menjadi pemindahan berpotensi (jumlah sampel darah tali pusat yang dikumpul ialah 2098), dengan berat badan 35 kg - 67%, dan hanya 25% sampel boleh menyediakan pemindahan yang berkesan pada pesakit dengan berat badan 50-70 kg. Keadaan klinikal ini menunjukkan keperluan untuk mengoptimumkan dan meningkatkan kecekapan kaedah sedia ada untuk mengumpul, membiak dan menyimpan sel darah tali pusat. Oleh itu, kesusasteraan pada masa ini secara meluas membincangkan isu penyeragaman kaedah mengumpul, menguji, mengasingkan dan mengawet darah tali pusat untuk mencipta bank darah, penggunaannya di klinik, dan juga menetapkan syarat dan syarat penyimpanan sel stem hematopoietik darah tali pusat.

[ 7 ], [ 8 ], [ 9 ]

Penggunaan sel stem hematopoietik darah tali pusat dalam perubatan

^{Biasanya, adalah mungkin untuk mengasingkan sehingga 10 6} sel stem hematopoietik daripada darah tali pusat, jarang lebih. Dalam hal ini, persoalan sama ada kuantiti sel hematopoietik sedemikian daripada darah tali pusat mencukupi untuk memulihkan hematopoiesis pada penerima dewasa masih terbuka sehingga hari ini. Pendapat mengenai perkara ini berpecah. Sesetengah penyelidik percaya bahawa kuantiti sedemikian agak mencukupi untuk pemindahan kepada kanak-kanak, tetapi terlalu sedikit untuk pemindahan kepada orang dewasa, yang mana jumlah optimum adalah pengenalan (7-10) x 10 ⁶ sel CD34-positif setiap 1 kg berat badan - purata 7 x 10 ⁸ setiap pemindahan. Daripada pengiraan ini, satu sampel darah tali pusat mengandungi 700 kali lebih sedikit sel stem hematopoietik daripada yang diperlukan untuk satu pemindahan kepada pesakit dewasa. Walau bagaimanapun, penilaian kuantitatif sedemikian dibuat dengan analogi dengan bilangan sel sumsum tulang yang ditransfusikan dan tidak mengambil kira ciri ontogenetik hematopoiesis sama sekali.

Khususnya, fakta potensi proliferatif sel stem hematopoietik darah tali pusat yang lebih tinggi berbanding sel progenitor hematopoietik sumsum tulang diabaikan. Keputusan kajian potensi pembentukan koloni in vitro menunjukkan bahawa satu dos darah tali pusat mampu menyediakan penyusunan semula hematopoiesis penerima dewasa. Sebaliknya, tidak boleh dilupakan bahawa bilangan sel stem darah tali pusat berkurangan walaupun semasa perkembangan embrio: kandungan sel CD34-positif dalam darah tali pusat berkurangan secara linear sebanyak 5 kali dalam tempoh dari 20 minggu (darah untuk kajian diperolehi semasa penamatan pramatang kehamilan) hingga 40 minggu kehamilan (tempoh acpaniel physiological yang meningkat secara berterusan), yang disertai dengan peningkatan linear fisiologi. penanda pembezaan sitod.

Disebabkan kekurangan pendekatan piawai untuk penentuan kuantitatif sel progenitor dalam sampel darah tali pusat, perdebatan tentang dos optimum sel stem hematopoietik darah tali pusat diteruskan. Sesetengah penyelidik percaya bahawa bilangan sel bernuklear dan sel mononuklear yang dikira semula untuk berat badan penerima, iaitu, dos mereka, boleh digunakan sebagai kriteria untuk memilih sampel darah tali pusat. Sesetengah pengarang percaya bahawa ambang kuantitatif minimum sel CD34+ walaupun untuk autotransplantasi HSC ialah 2 x 10 ⁶ /kg. Pada masa yang sama, peningkatan dalam dos sel hematopoietik kepada 5 x 10 ⁶ sel/kg (hanya 2.5 kali ganda) sudah memastikan perjalanan yang lebih baik dalam tempoh awal selepas pemindahan, mengurangkan kejadian komplikasi berjangkit dan memendekkan tempoh terapi antibiotik pencegahan.

Menurut E. Gluckman et al. (1998), dalam onkohematologi syarat untuk pemindahan sel darah tali pusat yang berjaya ialah pengenalan sekurang-kurangnya 3.7 x 10 ⁷ sel bernukleus bagi setiap 1 kg berat badan penerima. Apabila dos sel stem hematopoietik dikurangkan kepada 1 x 10 ⁷ atau kurang sel bernukleus bagi setiap 1 kg berat badan pesakit, risiko kegagalan pemindahan dan kambuh semula kanser darah meningkat dengan mendadak. Perlu diakui bahawa bilangan minimum sel progenitor yang diperlukan untuk pemulihan cepat hematopoiesis selepas allotransplantation HSC masih tidak diketahui. Secara teorinya, ini boleh dicapai menggunakan satu sel, tetapi dalam amalan klinikal pemindahan sumsum tulang, engraftment yang cepat dan stabil dijamin dengan pemindahan sekurang-kurangnya (1-3) x 10 ⁸ sel bernukleus setiap 1 kg berat badan pesakit.

Kajian terperinci baru-baru ini untuk menentukan bilangan optimum HSC dalam onkohematologi termasuk pemerhatian pesakit dalam tiga kumpulan, yang diperuntukkan bergantung kepada kandungan sel CD34-positif dalam bahan yang dipindahkan. Pesakit kumpulan pertama diberikan (3-5) x 10 ⁶ sel/kg. Dos HSC pada pesakit kumpulan kedua ialah (5-10) x 10 ⁶ sel/kg, dan pesakit kumpulan ketiga telah dipindahkan dengan lebih daripada 10 x 10 ⁶ CD34+ sel/kg. Keputusan terbaik diperhatikan dalam kumpulan penerima yang menerima pemindahan dengan bilangan sel CD34-positif bersamaan dengan (3-5) x 10 ⁶ /kg. Dengan peningkatan dalam dos sel yang dipindahkan melebihi 5 x 10 ⁶ /kg, kelebihan ketara secara statistik tidak didedahkan. Dalam kes ini, kandungan HSC yang sangat tinggi dalam pemindahan (> 10 x 10 ⁶ /kg) dikaitkan dengan penyerapan semula sejumlah besar sel tumor sisa, yang membawa kepada kambuh semula penyakit. Hubungan langsung antara bilangan sel progenitor alogenik yang dipindahkan dan perkembangan tindak balas graft-versus-host belum ditubuhkan.

Pengalaman dunia terkumpul pemindahan darah tali pusat mengesahkan potensi populasi semula yang tinggi. Kadar engraftment pemindahan darah tali pusat berkorelasi dengan bilangan sel bernukleus yang diperkenalkan. Keputusan terbaik diperhatikan dengan pemindahan 3 x 10 ⁷ /kg, manakala untuk sumsum tulang dos ini ialah 2 x 10 ⁸ /kg. Menurut data pusat penyelarasan, pada akhir tahun 2000, 1200 pemindahan sel darah tali pusat telah dilakukan di seluruh dunia, terutamanya daripada penderma yang berkaitan (83%). Adalah jelas bahawa darah tali pusat harus dipertimbangkan sebagai alternatif kepada sumsum tulang untuk pemindahan kepada pesakit dengan hemoblastosis.

Pada masa yang sama, sifat neonatal sumber kord tisu hematopoietik memberi inspirasi kepada keyakinan kerana kehadiran ciri-ciri fungsi HSCnya. Pada masa yang sama, hanya pengalaman klinikal boleh menjawab persoalan tentang kecukupan satu sampel darah tali pusat untuk memulihkan hematopoiesis pada penerima dewasa dengan aplasia hematopoietik. Pemindahan sel darah tali pusat digunakan dalam program rawatan untuk banyak penyakit tumor dan bukan tumor: leukemia dan sindrom myelodysplastic, limfoma dan neuroblastoma bukan Hodgkin, anemia aplastik, Fanconi kongenital dan anemia Diamond-Blackfan, kekurangan lekatan leukosit, Sindrom Barr, penyakit Gunther, penyakit thalass, thalass.

Aspek imunologi pemindahan sel hematopoietik darah tali pusat patut diberi perhatian dan kajian berasingan. Telah ditunjukkan bahawa dalam kes pemindahan sel stem darah tali pusat daripada penderma dengan keserasian HLA yang tidak lengkap, hasil pemindahan agak memuaskan, yang, menurut pengarang, menunjukkan imunoreaktiviti sel darah tali pusat yang lebih rendah daripada sumsum tulang.

Kajian terperinci tentang komposisi selular darah tali pusat mendedahkan ciri-ciri kedua-dua spektrum fenotip sel effector sistem imun dan aktiviti fungsinya, yang memungkinkan untuk mempertimbangkan darah tali pusat sebagai sumber HSC dengan risiko yang agak rendah untuk membangunkan tindak balas 'graft versus host'. Antara tanda-tanda ketidakmatangan fungsi sel imunokompeten darah tali pusat, adalah perlu untuk diperhatikan ketidakseimbangan dalam pengeluaran sitokin dan penurunan kepekaan terhadap peraturan sitokin tindak balas imun. Perencatan aktiviti limfosit sitotoksik yang terhasil dianggap sebagai faktor yang menyumbang kepada pembentukan toleransi imunologi kepada tisu hematopoietik yang dipindahkan. Dalam populasi limfosit darah tali pusat, berbeza dengan darah periferi dan sumsum tulang penderma dewasa, limfosit tidak matang dan sel penekan yang tidak aktif mendominasi. Ini menunjukkan penurunan kesediaan T-limfosit darah tali pusat untuk tindak balas imun. Ciri penting populasi monositik sel darah tali pusat ialah kandungan rendah sel pembentang antigen yang berfungsi penuh dan aktif.

Di satu pihak, kematangan rendah sel-sel effector sistem imun dalam darah tali pusat mengembangkan tanda-tanda untuk penggunaannya di klinik, kerana ciri-ciri ini memberikan penurunan dalam intensiti konflik imun antara sel penderma dan penerima. Tetapi, sebaliknya, diketahui tentang kewujudan korelasi antara tahap perkembangan tindak balas "graft versus host" dan kesan antitumor pemindahan, iaitu perkembangan kesan "graft versus leukemia". Dalam hal ini, satu kajian telah dijalankan ke atas sitotoksisiti antitumor sel darah tali pusat. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa, walaupun tindak balas sel darah tali pusat imunokompeten yang benar-benar lemah terhadap rangsangan antigen, limfosit yang diaktifkan terutamanya adalah pembunuh semula jadi dan sel seperti pembunuh yang mengambil bahagian aktif dalam mekanisme pelaksanaan sitotoksisiti antitumor. Di samping itu, subpopulasi limfosit dengan fenotip CD16+CD56+ dan CD16"TCRa/p+ ditemui dalam darah tali pusat. Diandaikan bahawa sel-sel ini dalam bentuk yang diaktifkan melaksanakan tindak balas "graft versus leukemia".

Di Institut Onkologi Akademi Sains Perubatan Ukraine, sel hematopoietik cryopreserved darah tali pusat diberikan kepada pesakit kanser dengan hipoplasia hematopoietik yang berterusan akibat kemo- dan radioterapi. Dalam pesakit sedemikian, pemindahan sel stem hematopoietik darah tali pusat agak berkesan memulihkan hematopoiesis tertekan, seperti yang dibuktikan oleh peningkatan berterusan dalam kandungan unsur-unsur matang yang terbentuk dalam darah periferi, serta peningkatan dalam penunjuk yang mencirikan keadaan imuniti selular dan humoral. Kestabilan kesan repopulasi selepas pemindahan sel hematopoietik darah tali pusat membolehkan radiasi dan kemoterapi berterusan tanpa mengganggu perjalanan rawatan. Terdapat maklumat tentang kecekapan allotransplantasi sel stem darah tali pusat kepada pesakit onkohematologi yang lebih tinggi: risiko tahunan kambuh semula penyakit tumor dengan penggunaannya ialah 25% berbanding 40% pada pesakit dengan sumsum tulang alogenik yang dipindahkan.

Mekanisme tindakan sel stem darah tali pusat cryopreserved harus dipertimbangkan sebagai hasil rangsangan humoral hematopoiesis penerima yang disebabkan oleh keupayaan unik sel neonatal untuk pengeluaran autokrin faktor pertumbuhan hematopoietik, serta akibat daripada pengukuhan sementara sel penderma (seperti yang dibuktikan oleh peningkatan yang boleh dipercayai dalam kandungan hemoglobin janin dalam darah periferal pada hari pertama transfusi berbanding darah 7-15 penerima). Ketiadaan tindak balas selepas pemindahan darah dalam penerima darah tali pusat adalah hasil daripada toleransi relatif sel imunokompetennya, serta kriteria keyakinan untuk kecukupan biologi bahan yang dipelihara.

Sel-sel progenitor pembunuh T-limfosit darah kord mampu diaktifkan di bawah pengaruh rangsangan sitokin eksogen, yang digunakan untuk membangunkan kaedah ex vivo dan in vivo baharu untuk mendorong sitotoksisiti antitumor unsur limfoid pemindahan untuk imunoterapi berikutnya. Di samping itu, "ketidakmatangan" genom sel imunokompeten darah tali pusat membolehkan mereka digunakan untuk meningkatkan aktiviti antitumor menggunakan kaedah pemodelan molekul.

Hari ini, darah tali pusat telah menemui aplikasi yang meluas terutamanya dalam hematologi pediatrik. Pada kanak-kanak yang menghidap leukemia akut, allotransplantasi sel stem hematopoietik darah tali pusat, berbanding dengan allotransplantasi sumsum tulang, mengurangkan dengan ketara kejadian penyakit graft-versus-host. Walau bagaimanapun, ini disertai dengan tempoh neutro dan trombositopenia yang lebih lama dan, malangnya, kadar kematian selepas pemindahan 100 hari yang lebih tinggi. Tempoh pemulihan tahap granulosit dan platelet yang lebih lama dalam darah periferal mungkin disebabkan oleh pembezaan subpopulasi individu sel darah kord positif CD34 yang tidak mencukupi, seperti yang dibuktikan oleh tahap penyerapan rhodamine radioaktif yang rendah dan ekspresi antigen CD38 yang rendah pada permukaannya.

Pada masa yang sama, pemindahan sel stem hematopoietik darah tali pusat kepada pesakit dewasa, dilakukan kerana ketiadaan kedua-dua penderma sumsum tulang yang tidak berkaitan dan kemungkinan menggerakkan HSC autologous, menunjukkan kelangsungan hidup bebas berulang satu tahun yang tinggi dalam kumpulan pesakit di bawah umur 30 tahun (73%). Memperluaskan lingkungan umur penerima (18-46 tahun) menyebabkan penurunan kelangsungan hidup kepada 53%.

Analisis kuantitatif sel dengan fenotip CD34+ dalam sumsum tulang dan darah tali pusat mendedahkan kandungannya yang lebih tinggi (3.5 kali) dalam sumsum tulang, tetapi dominasi sel yang ketara dengan profil fenotip CD34+HLA-DR dicatatkan dalam darah tali pusat. Adalah diketahui bahawa sel darah dengan penanda imunologi CD34+HLA-DR membiak lebih aktif daripada sel dengan immunophenotype CD34+HLA-DR+, yang telah disahkan dalam kajian eksperimen pertumbuhan kultur sel hematopoietik jangka panjang secara in vitro. Prekursor sel primitif dengan fenotip CD34+CD38 terkandung dalam kedua-dua darah tali pusat dan sumsum tulang, tetapi sel darah tali pusat dengan set penanda CD34+CD38 mempunyai aktiviti klonogenik yang lebih tinggi daripada sel hematopoietik fenotip yang sama yang diasingkan daripada sumsum tulang penderma dewasa. Di samping itu, sel darah tali pusat dengan imunofenotip CD34+CD38 membiak lebih cepat sebagai tindak balas kepada rangsangan sitokin (IL-3, IL-6, G-CSF) dan menghasilkan 7 kali lebih banyak koloni dalam kultur jangka panjang daripada sel sumsum tulang.

Bank Sel Stem Darah Tali

Untuk pembangunan yang betul bagi kawasan baru perubatan praktikal - pemindahan sel stem darah tali pusat, serta untuk pelaksanaan pemindahan sel stem hematopoietik sumsum tulang, adalah perlu untuk mempunyai rangkaian bank darah yang luas, yang telah pun dibuat di Amerika Syarikat dan Eropah. Rangkaian bank darah tali pusat disatukan oleh Persatuan Bank Netcord. Kesesuaian untuk mewujudkan persatuan antarabangsa bank darah tali pusat ditentukan oleh fakta bahawa sejumlah besar sampel darah tali pusat ditaip diperlukan untuk melakukan pemindahan yang tidak berkaitan, yang membolehkan memilih penderma yang serupa dengan HLA. Hanya penubuhan sistem bank dengan penyimpanan sampel darah pelbagai jenis HLA benar-benar dapat menyelesaikan masalah mencari penderma yang diperlukan. Organisasi sistem bank darah tali pusat memerlukan pembangunan awal norma etika dan undang-undang, yang kini sedang dibincangkan di peringkat antarabangsa.

Untuk mewujudkan bank darah tali pusat di Ukraine, satu siri peraturan dan dokumen mesti diuruskan.

Pertama sekali, ini adalah isu penyeragaman kaedah pengumpulan, pecahan dan pembekuan darah tali pusat. Ia adalah perlu untuk mengawal peraturan pengumpulan darah tali pusat di hospital bersalin mengikut keperluan etika perubatan, untuk menentukan jumlah minimum darah tali pusat yang memastikan pemindahan berjaya. Ia adalah perlu untuk membandingkan dan menyeragamkan pelbagai kriteria untuk menilai kualiti dan kuantiti sel progenitor hematopoietik, serta kaedah menaip HLA dan kaedah diagnostik untuk penyakit genetik dan berjangkit yang boleh dihantar semasa infusi sel darah tali pusat, untuk mewujudkan kriteria umum untuk pemilihan penderma yang sihat. Ia juga bernilai membincangkan isu mewujudkan kemudahan penyimpanan berasingan untuk serum, sel dan DNA yang diperoleh daripada darah tali pusat.

Ia amat perlu untuk mengatur rangkaian komputer data darah tali pusat untuk dihubungkan dengan pendaftaran penderma sumsum tulang. Untuk perkembangan selanjutnya pemindahan sel, adalah perlu untuk membangunkan protokol khas untuk membandingkan keputusan darah tali pusat dan pemindahan sumsum tulang daripada saudara-mara yang sama HLA dan penderma yang tidak berkaitan. Penyeragaman dokumentasi, termasuk persetujuan termaklum ibu bapa, serta pemberitahuan ibu atau saudara mara tentang penyakit genetik dan/atau berjangkit yang dikesan pada kanak-kanak, boleh membantu menyelesaikan masalah etika dan undang-undang penggunaan klinikal sel darah tali pusat.

Syarat yang menentukan untuk pembangunan transplantologi sel di Ukraine ialah penggunaan Program Derma Sel Stem Kebangsaan dan pembangunan kerjasama antarabangsa dengan negara lain melalui Persatuan Penderma Sumsum Dunia (WMDA), Program Penderma Sumsum Kebangsaan AS (NMDP) dan pendaftaran lain.

Merumuskan sejarah pendek perkembangan pemindahan sel stem hematopoietik darah tali pusat, kami perhatikan bahawa andaian pertama tentang kemungkinan menggunakan darah tali pusat di klinik, yang dinyatakan pada awal tahun 70-an, telah disahkan pada tahun 80-an oleh hasil kajian eksperimen ke atas haiwan, dan pada tahun 1988 pemindahan pertama di dunia bagi sel darah tali pusat hematopoie darah manusia telah dilakukan selepas rangkaian hematopoie darah tali pusat manusia. mula dicipta. Dalam 10 tahun, bilangan pesakit dengan sel hematopoietik darah tali pusat yang dipindahkan menghampiri 800. Antaranya adalah pesakit dengan pelbagai penyakit tumor (leukemia, limfoma, tumor pepejal) dan bukan tumor (kekurangan imuno kongenital, anemia, penyakit yang berkaitan dengan gangguan metabolik) sifat.

Kandungan prekursor sel awal dan komited dalam darah tali pusat adalah lebih tinggi daripada dalam darah periferi orang dewasa. Dari segi bilangan unit pembentuk koloni granulosit-makrofaj dan potensi proliferatifnya, darah tali pusat dengan ketara melebihi darah periferi orang dewasa walaupun selepas pengenalan faktor pertumbuhan. Dalam kultur sel jangka panjang secara in vitro, aktiviti proliferatif yang lebih besar dan daya maju sel darah tali pusat daripada sel sumsum tulang telah diperhatikan. Detik kritikal dalam pemindahan sel stem darah tali pusat ialah bilangan dan potensi hematopoietik sel bernukleus, kehadiran jangkitan sitomegalovirus, keserasian HLA penderma dan penerima, berat badan dan umur pesakit.

Walau bagaimanapun, pemindahan sel stem darah tali pusat harus dipertimbangkan sebagai alternatif kepada pemindahan sumsum tulang untuk rawatan penyakit darah yang teruk, terutamanya pada kanak-kanak. Masalah klinikal pemindahan sel darah tali pusat secara beransur-ansur diselesaikan - sudah ada kaedah yang agak berkesan untuk mengumpul, mengasingkan dan memelihara sel darah tali pusat, syarat-syarat disediakan untuk pembentukan bank darah tali pusat, dan kaedah untuk menguji sel bernukleus sedang diperbaiki. Larutan gelatin 3% dan larutan kanji hidroksietil 6% harus dianggap optimum untuk pengasingan semasa perolehan berskala besar sel stem hematopoietik darah tali pusat apabila mencipta bank.

P. Perekhrestenko dan pengarang bersama (2001) betul-betul ambil perhatian bahawa pemindahan sel stem darah tali pusat harus mengambil tempat yang sepatutnya dalam kompleks langkah-langkah terapeutik untuk mengatasi kemurungan hematopoietik pelbagai genesis, kerana sel stem darah tali pusat mempunyai beberapa kelebihan yang ketara, antaranya yang paling penting ialah kesederhanaan relatif perolehannya, ketiadaan virus, risiko rendah untuk jangkitan sel. kos pemindahan yang agak rendah. Sesetengah penulis menunjukkan bahawa pemindahan sel darah tali pusat kurang kerap disertai dengan komplikasi yang berkaitan dengan tindak balas graft-versus-host daripada pemindahan sel sumsum tulang, yang disebabkan, pada pendapat mereka, kepada ekspresi lemah antigen HLA-DR pada sel darah tali pusat dan ketidakmatangannya. Walau bagaimanapun, populasi utama sel bernukleus dalam darah tali pusat ialah limfosit T (sel positif CD3), kandungannya adalah kira-kira 50%, iaitu 20% kurang daripada darah periferi orang dewasa, tetapi perbezaan fenotip dalam subpopulasi sel T daripada sumber ini adalah tidak penting.

Antara faktor yang secara langsung mempengaruhi kadar kelangsungan hidup dalam pemindahan sel stem darah tali pusat, perlu diperhatikan umur pesakit (hasil terbaik diperhatikan pada penerima berumur dari satu hingga lima tahun), diagnosis awal penyakit dan bentuk leukemia (keberkesanan adalah lebih tinggi dengan ketara dalam leukemia akut). Sangat penting ialah dos sel darah tali pusat bernukleus, serta keserasian HLA dengan penerima. Bukan kebetulan bahawa analisis keberkesanan klinikal pemindahan HSC darah tali pusat dalam onkohematologi menunjukkan hasil rawatan terbaik apabila menggunakan pemindahan berkaitan: kelangsungan hidup tanpa kambuh satu tahun dalam kes ini mencapai 63%, manakala dengan pemindahan yang tidak berkaitan - hanya 29%.

Oleh itu, kehadiran sejumlah besar sel stem dalam darah tali pusat dan kapasiti repopulasi tinggi sel stem hematopoietik neonatal membolehkan mereka digunakan untuk pemindahan alogenik dalam pesakit onkohematologi. Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa rekapitulasi hematopoiesis selepas pemindahan sel hematopoietik darah tali pusat "diregangkan dalam masa": pemulihan kandungan neutrofil dalam darah periferi biasanya diperhatikan pada akhir minggu ke-6, dan trombositopenia biasanya hilang selepas 6 bulan. Di samping itu, ketidakmatangan sel hematopoietik darah tali pusat tidak mengecualikan konflik imunologi: penyakit graft-versus-host akut dan kronik yang teruk diperhatikan dalam 23 dan 25% penerima, masing-masing. Kambuhan leukemia akut menjelang akhir tahun pertama selepas pemindahan sel darah tali pusat dicatatkan dalam 26% kes.

[ 10 ], [ 11 ]