Sel stem Mesenchymal

Antara sel stem serantau, sel stem mesenchymal (MSC) menduduki tempat yang khusus, derivatif yang membentuk matriks stromal semua organ dan tisu badan manusia. Keutamaan dalam penyelidikan MSC adalah kepunyaan wakil sains biologi Rusia.

Pada pertengahan abad yang lalu, budaya homogen dari pelbagai sel stem sumsum tulang stromal yang pertama diasingkan di makmal A. Friedenshtein. Sel-sel stem mesenchymal melekat pada substrat untuk masa yang lama mengekalkan kadar yang tinggi percambahan, dan budaya pada kepadatan pembenihan rendah selepas penetapan pada substrat terbentuk daripada klon sel fibroblast tidak mempunyai aktiviti phagocytic. Penghentian percambahan MSC ditamatkan oleh pembezaan in vitro secara spontan ke dalam sel tulang, lemak, rawan, otot atau tisu penghubung. Kajian selanjutnya menunjukkan potensi osteogenic sel-sel sum-sum tulang stromal fibroblast seperti spesies yang berbeza mamalia, serta aktiviti koloni-membentuk. Dalam eksperimen in vivo ia menunjukkan bahawa kedua-dua pemindahan hetero- dan orthotopic fibroblast koloni sel membentuk adalah selesai membentuk tulang, tulang rawan, dan tisu lemak berserabut. Kerana sel stromal stem sumsum tulang yang dicirikan oleh kapasiti yang tinggi untuk pembaharuan diri dan pembezaan pengisi dalam talian sel yang sama, mereka dipanggil sel-sel leluhur mesenchymal multipotent.

Harus diingat bahawa selama 45 tahun penyelidikan asas sel stem mesenchymal, keadaan sebenar telah dibuat untuk penggunaan derivatif mereka dalam amalan klinikal.

Hari ini, tidak ada keraguan bahawa semua tisu-tisu tubuh manusia terbentuk dari sel stem sel-sel sel yang berlainan sebagai hasil daripada proses percambahan, penghijrahan, pembezaan dan pematangan. Walau bagaimanapun, baru-baru ini, dipercayai bahawa sel stem dalam badan dewasa adalah tisu khusus, iaitu, mampu mengeluarkan sel-sel sel khusus hanya pada tisu yang terletaknya. Keadaan konseptual ini disangkal oleh fakta-fakta transformasi sel-sel stem hematopoietik bukan sahaja ke dalam sel-sel sel darah periferal, tetapi juga ke sel-sel hati lekuk. Di samping itu, sel-sel stem neural dapat menimbulkan kedua-dua neuron dan unsur glial, serta sel-sel awal leluhur sel hematopoietik. Sebaliknya, sel stem mesenchymal, biasanya menghasilkan unsur-unsur sel tulang, rawan dan tisu adipose, dapat berubah menjadi sel induk saraf. Diandaikan bahawa dalam proses pertumbuhan, pertumbuhan semula fisiologi dan reparasi tisu, sel-sel progenitor yang tidak dikutip dihasilkan daripada rizab batang tisu khusus. Sebagai contoh, pembaikan tisu otot dapat direalisasikan melalui sel stem mesenchymal yang berpindah dari sumsum tulang ke otot rangka.

Walaupun sel-sel stem silang tukar seperti mengenali bukan semua penyelidik kemungkinan penggunaan klinikal sel-sel mesenchymal stem sebagai sumber untuk pemindahan sel dan vektor sel maklumat genetik telah tidak dipertikaikan sebagai sel stem stromal multipotent tulang sumsum, yang boleh menjadi agak mudah untuk mengasingkan dan menyebarkan dalam budaya in vitro. Pada masa yang sama dalam kesusasteraan saintifik terus muncul laporan mengenai potensi sel stem pluripotent daripada stroma sumsum tulang. Sebagai bukti yang dikemukakan protokol penyelidikan, yang di bawah pengaruh inducers tertentu transdifferentiation daripada MSCs ditukar kepada saraf sel-sel, cardiomyocytes dan hepatosit. Walau bagaimanapun, sesetengah saintis peluang untuk semula pengaktifan dan gen semasa embriogenesis awal dalam keraguan yang serius. Pada masa yang sama, semua orang memahami bahawa jika keadaan yang untuk mengembangkan sel stem mesenchymal multipotent untuk pluripotency daripada ESCS dalam perubatan regeneratif dan plastik secara automatik menyelesaikan banyak masalah etika, moral, agama dan undang-undang alam semula jadi. Tambahan pula, kerana dalam kes ini punca stem kapasiti penjanaan semula pesakit adalah sel-sel stromal autologous diselesaikan dan masalah penolakan imun pemindahan sel. Bagaimana realistik prospek masa terdekat akan dipaparkan.

[1], [2]

Penggunaan sel stem mesenchymal dalam perubatan

Penggunaan klinik derivatif sel stem mesenchymal dikaitkan terutamanya dengan pengurangan kecacatan tisu yang disebabkan oleh luka-luka haba yang menyeluruh dan mendalam kulit. Penilaian eksperimen pra-klinikal kesesuaian sel-sel stem mesenchymal fibroblast seperti allogenic untuk merawat luka terbakar yang mendalam telah dijalankan. Ia menunjukkan bahawa sel-sel sum-sum tulang mesenchymal stem fibroblast seperti membentuk monolayer di daerah budaya, yang menjadikan ia mungkin untuk pemindahan mereka untuk mengoptimumkan pertumbuhan semula luka terbakar dalam. Penulis ambil perhatian bahawa hartanah yang serupa mempunyai fibroblas embrio, tetapi permohonan klinikal kedua adalah terhad kepada masalah etika dan undang-undang yang sedia ada. Pembakaran haba yang mendalam dengan kerosakan kepada semua lapisan kulit dimodelkan pada tikus Wistar. Kawasan pembakaran adalah 18-20% daripada permukaan keseluruhan kulit. Dalam kumpulan eksperimen pertama terdiri daripada tikus dengan kecederaan haba yang mendalam dan pemindahan sel stem mesenchymal fibroblast yang diperolehi allogeneic. Kumpulan kedua terdiri daripada haiwan dengan luka terbakar haba dalam dan trans-ladang fibroblas embrio allogeneic. Kumpulan ketiga tikus kawalan telah disediakan dengan kecederaan haba dalam, yang tidak menjalankan terapi sel. A penggantungan sel-sel stem mesenchymal fibroblast yang diperolehi dan fibroblas embrio telah digunakan untuk permukaan luka terbakar pipetted dalam jumlah sebanyak 2 × 10 ⁴ sel pada hari ke-2 selepas pemotongan pemodelan membakar dan eschar necrotic terbentuk. Selepas pemindahan, sel-sel membakar permukaan ditutup dengan kain kasa yang direndam dalam larutan natrium klorida isotonik dengan gentamicin. Pagar sel-sel sum-sum tulang untuk mendapatkan MSC dengan induksi berikutnya barisan fibroblast dalam sel-sel stem mesenchymal dihasilkan pada tikus Wistar dewasa dari femurs. Fibroblas embrio diperolehi daripada paru-paru embrio berusia 14-17 hari. Fibroblas embrio dan sel-sel sum-sum tulang untuk mendapatkan pra-MSC dikulturkan dalam hidangan Petri pada 37 ° C dalam iikubatore C02, dalam suasana yang dengan 5% CO2 pada 95% kelembapan. Fibroblas embrio dikultur untuk 4-6 hari, manakala bagi pembentukan monolayer MSC diperlukan 14-17 hari. Selepas itu MSC dikekalkan oleh krioawetan sebagai bahan permulaan untuk sel-sel mesenchymal stem fibroblast yang diperolehi yang telah disediakan oleh pencairan dan pengkulturan MSC selama 4 hari. Bilangan sel-sel stem mesenchymal fibroblast yang dihasilkan adalah lebih daripada 3 kali jumlah fibroblas embrio yang timbul dalam tempoh budaya yang sama. Untuk mengenal pasti sel-sel dalam transtslantirovannyh membakar luka dalam langkah pengkulturan genom mereka dilabel menggunakan vektor ulang-alik virus berdasarkan rekombinan adenovirus V jenis carrier 1AS-2 gen pengekodan ß-galactosidase E. Coli. Sel-sel hidup pada masa-masa selepas pemindahan dikesan immunohistochemically dalam cryosections dengan campuran karbohidrat X-Gal, memberikan warna biru-hijau ciri. Hasil daripada dinamik visual, planimetric dan keadaan penilaian histologi luka terbakar, didapati bahawa walaupun pada hari ke-3 selepas pemindahan sel-sel dalam kumpulan terpencil muncul perbezaan ketara pada luka proses penyembuhan. Khususnya berbeza, perbezaan ini menjadi pada hari ke-7 selepas pemindahan sel. Haiwan daripada kumpulan pertama, yang telah dipindahkan sel mesenchymal stem fibroblast-suka, luka diperolehi warna kuat seragam cerah, tisu granulation meningkat ke atas keseluruhan kawasan kepada tahap epidermis, dan membakar permukaan dikurangkan dalam saiz. Beberapa membentuk filem kolagen nipis ke permukaan luka, tetapi dia terus meliputi keseluruhan kawasan yang terbakar. Haiwan kumpulan kedua, yang telah dipindahkan fibroblas embrio, tisu granulation diangkat ke tahap epidermis tepi luka, tetapi hanya di beberapa tempat, pada masa yang sama plazmoreya dari luka itu lebih kuat daripada dalam kumpulan 1, dan pada awalnya terbentuk filem kolagen hampir hilang. Pada haiwan yang tidak menerima terapi sel stem, pada luka hari membakar ke-7 adalah pucat, berbintik-Tompok, tisu necrotic, disalut dengan fibrin. Plasmorrhea diperhatikan sepanjang permukaan terbakar. Histologi, binatang di 1 dan 2 kumpulan menunjukkan penurunan sebanyak penyusupan dan pembangunan vasculature selular, tanda-tanda proses penjana semula yg baru jadi menjadi lebih teruk dalam tikus dalam Kumpulan 1. Dalam kumpulan kawalan menunjukkan tanda-tanda sel luka penyusupan, pola histologic saluran darah baru ditubuhkan tidak hadir. Hari 15-30 th pemerhatian binatang di kawasan permukaan kumpulan membakar 1 adalah jauh lebih kecil daripada pada tikus kumpulan lain dan permukaan granulating lebih maju. Dalam haiwan daripada kumpulan 2 kawasan permukaan terbakar juga menurun berbanding dengan saiz luka terbakar dalam kumpulan kawalan tikus yang disebabkan oleh epithelization marginal. Dalam kawalan kumpulan laman permukaan terbakar kekal granulations pucat dengan yang jarang berlaku, yang terdapat di atasnya urat labah-labah, pulau-pulau kecil adalah plak fibrinous terus plazmoreya sederhana di seluruh permukaan terbakar, sesuatu yang kuping cerai sukar kekal. Secara umum, haiwan kumpulan 3 juga mengurangkan saiz luka, tetapi luka kekal tepi podrytymi.

Oleh itu, semasa kajian perbandingan kadar penyembuhan luka menggunakan sel stem mesenchymal fibroblast yang diperolehi dan fibroblas janin, dan tanpa menggunakan terapi sel ditanda pecutan penyembuhan permukaan terbakar akibat pemindahan sel stem mesenchymal fibroblast yang diperolehi dan fibroblas embrio. Walau bagaimanapun, dalam kes menggunakan sel-sel mesenchymal stem allogeneic fibroblast luka kadar penyembuhan adalah lebih tinggi daripada di pemindahan fibroblas embrio. Ini telah ditunjukkan dalam mempercepatkan perubahan fasa pertumbuhan semula proses - untuk mengurangkan tempoh penyusupan sel, meningkatkan kadar percambahan rangkaian vaskular, serta pembentukan tisu granulation.

Hasil planimetri dinamik menunjukkan bahawa kadar penyembuhan spontan luka bakar (tanpa penggunaan terapi sel) adalah yang paling rendah. Pada 15 dan ke-30 selepas pemindahan sel stem mesenchymal allogeneic fibroblast luka kadar penyembuhan adalah lebih tinggi daripada di pemindahan fibroblas embrio. Cara histochemical untuk mengesan beta-galactosidase menunjukkan bahawa selepas pemindahan sel stem mesenchymal fibroblast-suka dan fibroblas embrio sepanjang tempoh keseluruhan pemerhatian di permukaan dan mendalam regenerasi luka dipindahkan sel kekal berdaya maju. Penulis mencadangkan bahawa kadar yang lebih tinggi membakar luka sembuh semula menggunakan sel stem mesenchymal fibroblast pelepasan dingin oleh sel-sel ini semasa kematangan rostostimuliruyushih faktor bioaktif.

Pemindahan daripada autologous atau keratinosit allogenic dan fibroblas allogeneic untuk rawatan luka terbakar dan digunakan di klinik. Perlu diingatkan bahawa rawatan pembedahan kanak-kanak dengan terbakar mendalam menyeluruh adalah satu tugas yang rumit kerana kepelbagaian yang tinggi trauma dan pembedahan campur tangan, kehilangan darah yang ketara, reaksi yang berbeza yang digunakan media infusi. Masalah utama dalam pelaksanaan kulit dan pembedahan plastik dengan terbakar mendalam menyeluruh, kawasan yang melebihi 40% daripada permukaan badan, kerana keterukan keadaan beliau dan kekurangan sumber kulit penderma. Penggunaan cantuman mesh dengan nisbah perforation besar tidak menyelesaikan masalah, kerana imej selepas penembusan sel epiteliziruyutsya adalah sangat perlahan, dan sering melakukan cantuman kulit yang lysed atau kering. Lapisan itu membakar luka sebagai ksenokozha, allografts yang sudah meninggal dunia, lapisan filem sintetik tidak sentiasa cukup berkesan, jadi pembangunan kaedah baru bagi penutupan lapisan permukaan membakar keratinosit berbudaya dan fibroblas. Khususnya, satu kaedah menutup permukaan membakar menggunakan allofibroblastov berbudaya menyediakan semasa pemindahan ketara kesan perangsangan pada epidermotsitov percambahan dipelihara dalam sempadan luka pada luka bakar, dan dalam keratinocyte cantuman mesh webs. Dalam al Budkevich L. Et (2000) menunjukkan keputusan menggunakan kaedah ini untuk rawatan luka terbakar pada kanak-kanak. 31 kanak-kanak dengan trauma terma berusia antara 1 hingga 14 tahun berada di bawah pemerhatian. Pada tiga kanak-kanak jumlah kawasan membakar luka IIIA-B - Ijazah IV adalah 40%, 25 - 50-70%, walaupun pada tiga - 71-85% daripada permukaan badan. Necrectomy pembedahan awal digabungkan dengan pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya dan autodermaplasty. Dalam rawatan peringkat pertama telah dijalankan pemotongan tisu necrotic, kedua - pada pemindahan berbudaya filem carrier allofibroblastov, ketiga (48 jam selepas pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya) - penyingkiran matriks dan kulit kepak dengan nisbah perforation autodermoplasty 1: 4. Tiga pesakit yang dimasukkan ke hospital dengan penyakit luka terbakar yang teruk, allofibroblasty berbudaya telah dipindahkan pada granulating luka. Pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya dilakukan sekali dalam 18 kanak-kanak, dua kali - pada 11, 3-2 pesakit. Kawasan permukaan luka yang dilindungi oleh budaya sel adalah dari 30 hingga 3500 cm2. Keberkesanan allofibroblastov berbudaya dinilai oleh jumlah peratusan engraftment kepak kulit, masa penyembuhan luka terbakar dan jumlah kematian kecederaan haba yang teruk. Pengguguran transplantasi lengkap pada 86% pesakit. Puncak kulit tidak separa separa dicatatkan dalam 14% kes. Walaupun rawatan berterusan, enam (19.3%) kanak-kanak mati. Jumlah lesi kulit di dalamnya adalah dari 40 hingga 70% permukaan badan. Pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya tidak mempunyai berhubung dengan kematian kelecuran pesakit tunggal.

Menganalisis keputusan rawatan, penulis ambil perhatian bahawa luka bakar sebelum tidak serasi dengan kehidupan, untuk merawat kerosakan haba dalam kawasan kulit 35-40% daripada permukaan badan (untuk kanak-kanak - sehingga 3 tahun - yang terbakar dalam kritikal dengan keluasan 30%, untuk kanak-kanak lebih tua kumpulan umur - ke atas sebanyak 40% daripada permukaan badan). Apabila pemindahan pembedahan berbudaya autodermaplasty necrectomy allofibroblastov dan kulit berikutnya cantuman dengan kebakaran besar, perforation faktor IIIB - Ijazah IV kekal kritikal, tetapi pada masa ini terdapat prospek dalam banyak kes untuk menyelamatkan nyawa walaupun mangsa itu. Necrectomy pembedahan sempena pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya dan autodermaplasty pada kanak-kanak dengan terbakar mendalam terbukti berkesan dalam pesakit dengan luka-luka maju kulit dengan defisit laman penderma. Taktik pembedahan aktif dan pemindahan allofibroblastov berbudaya menggalakkan penstabilan pesat keadaan umum pesakit itu, pengurangan jumlah komplikasi berjangkit penyakit terbakar, mewujudkan keadaan yang baik untuk engraftment, mengurangkan masa untuk memulihkan kulit yang hilang dan tempoh rawatan hospital, mengurangkan kadar kematian di kalangan pesakit yang terbakar yang menyeluruh. Oleh itu, pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya sejajar kepak kulit autodermaplasty mencapai pemulihan kanak-kanak dengan kebakaran yang teruk, yang sebelum ini dianggap mustahil.

Adalah diiktiraf secara meluas bahawa objektif utama merawat penyakit membakar adalah untuk memaksimumkan pemulihan kulit yang rosak dan cepat untuk mengelakkan berlakunya kesan toksik, komplikasi berjangkit dan penyahhidratan badan. Hasil penerapan sel-sel berbudaya sebahagian besarnya bergantung kepada kesediaan untuk transplantasi luka bakar itu sendiri. Dalam kes-kes pemindahan keratinosit berbudaya ke permukaan luka selepas pembedahan necrectomy prizhivlyaetsya purata 55% (mengikut kawasan) sel dipindahkan, dan pada luka granulating Kadar engraftment dikurangkan kepada 15%. Oleh itu, rawatan yang berjaya dalam luka bakar kulit yang mendalam memerlukan, di tempat pertama, taktik pembedahan aktif. Di hadapan luka terbakar IIIB-IV, permukaan terbakar segera dikeluarkan dari tisu nekrotik untuk mengurangkan kesan mabuk dan mengurangkan jumlah komplikasi penyakit bakar. Penggunaan taktik sedemikian adalah kunci untuk mengurangkan masa dari saat membakar ke penutupan luka dan lama tinggal pesakit dengan luka bakar yang meluas di hospital, dan juga mengurangkan jumlah kematian.

Laporan pertama mengenai penggunaan keratinocyte yang berjaya untuk menutup permukaan membakar muncul pada awal tahun lapan puluhan abad yang lalu. Selanjutnya, manipulasi ini dilakukan dengan bantuan lapisan keratinosit yang berbudaya, yang paling sering diperoleh daripada autostructures, lebih kurang sering daripada allokeratinocytes. Walau bagaimanapun, teknologi autokeratinocytoplasty tidak membenarkan penciptaan sebuah bank sel, manakala masa yang diperlukan untuk menghasilkan kerajinan yang mencukupi dari keratinosit adalah besar dan berjumlah 3-4 minggu. Dalam tempoh ini, risiko membina penyakit komplikasi dan lain-lain komplikasi penyakit membakar bertambah dengan ketara, yang mana memanjangkan panjang jumlah pesakit di hospital. Di samping itu, autokeratinocytes tidak dapat hidup semasa pemindahan ke granulating luka bakar, dan kos tinggi media pertumbuhan khas dan perangsang pertumbuhan keratinocyte secara biologi yang aktif membataskan aplikasi klinikal mereka. Kaedah bioteknologi lain, seperti kolagenoplasti, transplantasi xenoid cryopreserved, dan penggunaan pelbagai lapisan biopolimer meningkatkan keberkesanan rawatan permukaan luas tetapi tidak dalam luka bakar yang mendalam. Kaedah salutan permukaan luka dengan fibroblas berbudaya pada asasnya berbeza kerana komponen utama kolam sel kultur bukan keratinosit tetapi fibroblas.

Satu prasyarat untuk pembangunan kaedah yang berkhidmat sebagai bukti bahawa pericytes yang mengelilingi kapal kecil adalah pro- sel genitornymi mesenchymal mampu untuk berubah menjadi fibroblas, yang menghasilkan faktor pertumbuhan banyak dan menyediakan penyembuhan luka kerana kesan merangsang yang kuat pada percambahan dan lekatan keratinosit. Menggunakan fibroblas berbudaya untuk menutup permukaan luka segera mengenal pasti beberapa kelebihan kaedah ini ke atas penggunaan keratinosit berbudaya. Khususnya, penyediaan fibroblas dalam budaya tidak memerlukan penggunaan media budaya dan pertumbuhan promoter khas, yang mengurangkan kos pemindahan lebih daripada 10 kali kos mendapatkan keratinosit. Fibroblas mudah tertakluk kepada passaging, di mana mereka sebahagiannya kehilangan antigen permukaan histocompatibility mereka, yang seterusnya menjadikan ia mungkin untuk menggunakan untuk mengeluarkan pemindahan allogeneic sel dan mewujudkan bank mereka. Memendekkan pemindahan menerima, sedia untuk digunakan di klinik, dari 3 minggu (keratinosit) 1-2 hari (untuk fibroblas). Budaya utama fibroblas boleh diperolehi dengan pengkulturan sel daripada serpihan kulit diambil pada autodermoplasty dan pembenihan sel ketumpatan pada subbudaya penerimaan fibroblas manusia hanya 20 × 10 ³ setiap 1 cm ².

Untuk mengkaji kesan fibroblas dan protein peraturan mereka dalam percambahan dan pembezaan keratinosit, analisis perbandingan ciri-ciri dan morfologi keratinocyte percambahan pada substrat jenis kolagen I dan III dan fibronectin dalam ko-budaya dengan fibroblas manusia. Keratinosit manusia telah diasingkan daripada serpihan kulit pesakit dengan luka bakar yang diambil semasa operasi autodermoplasti. Ketumpatan keratinosit adalah 50 x 103 sel per cm2. Keberkesanan klinikal transplantasi fibroblas berbudaya dinilai pada 517 pesakit. Semua pesakit dibahagikan kepada dua kumpulan: 1 - orang dewasa yang terkena luka IIA, B - IV; 2 - kanak-kanak dengan luka terbakar IIIB - IV. Penilaian dinamik organisasi struktur dan fungsi budaya monolayer fibroblas dengan mengambil kira peranan dalam proses pemulihan daripada glycosaminoglycans, fibronectin, kolagen, dan membenarkan penulis untuk menentukan hari ketiga sebagai syarat-syarat yang paling baik menggunakan budaya fibroblast untuk pengeluaran pemindahan organ. Penyiasatan kesan kepada percambahan fibroblast dan pembezaan keratinosit menunjukkan bahawa di bawah in vitro fibroblas mempunyai kesan ketara merangsang, terutamanya kepada proses lekatan keratinocyte, meningkatkan bilangan sel-sel pengikut dan kadar menetapkan lebih daripada 2 kali. Rangsangan proses lekatan disertai dengan peningkatan intensiti sintesis DNA dan tahap percambahan keratinosit. Tambahan pula, didapati bahawa kehadiran fibroblas dan matriks extracellular dibentuk oleh mereka adalah pra-syarat untuk pembentukan tonofibrillyarnogo radas keratinocyte Kenalan intercellular dan, akhirnya, untuk pembezaan keratinocyte dan pembentukan membran bawah tanah. Dalam rawatan kanak-kanak dengan terbakar mendalam ditubuhkan keberkesanan klinikal budaya pemindahan allofibroblastov, terutamanya pada pesakit dengan luka-luka yang banyak daripada tempat yang paling penderma kulit dalam defisit. Kajian morfofunktcionalnoe kompleks menunjukkan bahawa rasuah dicirikan fibroblas sintesis DNA aktif, serta kolagen, fibronectin dan glycosaminoglycans, yang dihasilkan dalam sel-sel matriks extracellular. Penulis mencadangkan peratusan yang tinggi engraftment fibroblas dipindahkan (96%), pengurangan mendadak dari segi persediaan mereka (dalam 2-3 jam dan bukannya 24-48 minggu dalam hal keratinosit), pecutan besar epithelization permukaan hangus sahaja, pengurangan yang ketara dalam harga (dalam 10 kali) teknologi menanam graft dari fibroblast berbanding dengan pemindahan keratinocyte. Penggunaan pemindahan daripada allofibroblastov berbudaya menjadikan ia mungkin untuk menyelamatkan nyawa kanak-kanak yang terbakar kritikal - kecederaan haba lebih 50% daripada permukaan badan, yang sebelum ini dianggap tidak sesuai dengan kehidupan. Perlu diperhatikan bahawa pemindahan allogeneic fibroblas embrio juga meyakinkan terbukti bukan sahaja pertumbuhan semula lebih cepat luka dan pesakit pemulihan dengan pelbagai membakar ijazah dan kawasan, tetapi juga pengurangan yang besar kematian.

Fibroblas autologous digunakan dalam apa-apa pembedahan rumit dan plastik sebagai kerosakan pembetulan penggantian pita suara. Biasanya digunakan untuk tujuan ini kolagen lembu, tempoh tindakan yang dihadkan oleh immunogenicity itu. Sebagai protein asing, kolagen lembu, collagenase sensitif kepada penerima dan boleh menyebabkan reaksi imun, untuk mengurangkan risiko yang teknologi persediaan kolagen telah dibangunkan, salib berkaitan dengan glutaraldehyde. Kelebihan mereka ialah kestabilan dan immunogenicity lebih rendah, yang telah menemui aplikasi praktikal dalam penyingkiran kecacatan dan atrofi saraf vokal. Suntikan kolagen autologous pertama kali digunakan pada tahun 1995. Kaedah yang disediakan pemuliharaan binaan utama serat kolagen autologous, termasuk silang ini intramolecular enzim pemangkin. Hakikat bahawa serat kolagen semula jadi adalah lebih tahan kepada pencemaran oleh protease daripada telopeptides kolagen semula mana dipotong. Integriti telopeptides penting untuk struktur terdiri dr empat gentian kolagen dan silang antara molekul kolagen bersebelahan. Tidak seperti persediaan kolagen bovine, kolagen autologous tidak menyebabkan tindak balas imun dalam penerima, tetapi ia tidak cukup berkesan sebagai mengisi ejen. Pembetulan berterusan boleh dicapai disebabkan oleh pengeluaran tempatan pemindahan autologous kolagen oleh fibroblas. Walau bagaimanapun, penyiasatan keberkesanan pemindahan fibroblas autologous di klinik mendedahkan beberapa kesukaran. Pada tempoh yang awal selepas kesan klinikal pemindahan fibroblast adalah lebih lemah dibandingkan dengan selepas pentadbiran kolagen lembu. Apabila fibroblas autologous berbudaya tidak boleh menolak kemungkinan transformasi fibroblas normal dalam tidak normal, myofibroblasts yang dipanggil, yang bertanggungjawab ke atas pembangunan fibrosis dan parut, seperti yang dibuktikan oleh penurunan dalam gel kolagen, kerana interaksi tertentu fibroblas dan gentian halus kolagen. Selanjutnya, selepas passaging siri fibroblas in vitro hilang keupayaan mereka untuk mensintesis protein matriks extracellular.

Penanaman Walau bagaimanapun, pada masa ini teknik eksperimen disempurnakan fibroblas autologous manusia, yang menghapuskan kelemahan di atas dan membawa kepada transformasi onkogenik fibroblas normal. Fibroblas autologous yang diperoleh dengan kaedah ini digunakan untuk mengisi kecacatan tisu-tisu lembut muka. Dalam kajian oleh H. Keller dan co-authors (2000), 20 pesakit berusia 37 hingga 61 tahun dengan kerutan dan parut atropik mendapat rawatan. Biopsi kulit (4 mm) rantau BTE kita diangkut ke makmal dalam tiub steril mengandungi 10 ml medium budaya (Dulbecco mikoseptikom antibiotik, pyruvate dan janin bovine serum). Bahan itu diletakkan dalam 3-5 cawan budaya dengan diameter 60 mm dan diinkubasi dalam termostat dengan atmosfer yang mengandung 5% CO2. Selepas 1 minggu, sel-sel telah dikeluarkan dari piring dengan trypsinization dan diletakkan dalam botol 25 cm2. Sel diberikan kepada pesakit dalam jumlah sebanyak 4 x 107. Kesan klinikal yang ketara dan tahan lama diperhatikan pada pesakit dengan pembetulan lipatan nasolabial, dan pada pesakit dengan parut selepas 7 hingga 12 bulan selepas pemindahan ketiga fibroblas autologous. Menurut aliran sitometri, fibroblas berbudaya menghasilkan sejumlah besar kolagen Tipe I. Kajian in vitro, kontraksi normal fibroblast suntikan ditunjukkan. Dua bulan selepas pentadbiran subkutaneus fibroblast berbudaya dengan dos 4 x 107, tikus bogel tidak dikesan. Fibroblas suntik tidak menyebabkan pembentukan parut dan fibrosis meresap pada pesakit. Menurut penulis, fibroblas autologous yang ditanam dapat menghasilkan kolagen secara terus-menerus, yang akan memberikan kesan peremajaan kosmetik. Dalam kes ini, kerana jangka hayat sel dibezakan adalah terhad, fibroblas diambil dari pesakit muda lebih berkesan daripada yang diperolehi pada orang tua. Pada masa akan datang, kemungkinan kemboja melindungi kultur fibroblast yang diambil dari penderma muda dianggap sebagai transplantasi kemudian kepada pesakit tua sel-sel muda sendiri. Kesimpulannya, ia tidak kesimpulan agak betul yang fibroblas autologous, dengan syarat keselamatan kerja mereka adalah sesuai untuk pembetulan muka kecacatan tisu lembut. Pada masa yang sama, penulis sendiri menyatakan bahawa dalam proses penyelidikan beberapa masalah bermasalah yang berkaitan dengan penggunaan sistem fibroblast-kolagen autologous juga timbul. Kesan klinikal selalunya lebih lemah daripada dengan penggunaan kolagen lembu, yang menyebabkan kekecewaan pada pesakit.

Secara umum, data kesusasteraan mengenai prospek penggunaan klinik sel stem mesenchymal kelihatan agak optimistik. Percubaan dibuat untuk menggunakan sel-sel progenitor mesenchymal multipoten tulang sumsum autologous untuk rawatan lesi sendi degeneratif. Ujian klinikal pertama bagi sel-sel progenitor mesenchymal yang berbudaya dalam rawatan tulang fraktur kompleks dilakukan. Autologous dan allogeneic mesenchymal sel-sel sum-sum tulang stromal digunakan untuk menjana tisu rawan untuk pemindahan dalam pembetulan kecacatan artikular rawan disebabkan oleh trauma, atau luka-luka autoimun. Kaedah diamalkan permohonan klinikal sel mesenchymal leluhur multipotent untuk membetulkan kecacatan tulang pada kanak-kanak dengan kemajuan osteogenesis teruk disebabkan oleh mutasi jenis I gen kolagen. Selepas mieloabelyatsii kanak-penerima sumsum tulang dipindahkan dari penderma sihat HLA riba sebagai sumsum tulang unfractionated mungkin mengandungi jumlah yang mencukupi sel-sel stem mesenchymal untuk menambah kecacatan tulang yang teruk. Selepas pemindahan tulang sumsum allogeneik, kanak-kanak tersebut mempunyai perubahan histologi positif dalam tulang trabekular, peningkatan kadar pertumbuhan dan penurunan dalam keretakan tulang. Dalam sesetengah kes, hasil klinikal positif dicapai dengan memindahkan tulang sumsum allogeneic dan osteoblas yang rapat. Untuk rawatan kerapuhan kongenital tulang kerana ketidakseimbangan osteoblas dan osteoklas dalam tisu tulang, MSK pemindahan juga digunakan. Pemulihan pembentukan tulang dalam kes ini dicapai disebabkan oleh penyejukan kolam stem dan progenitor sel trombosit dalam tisu tulang pesakit.

Kaedah pengubahsuaian genetik sel stem mesenchymal penderma sedang diperbaiki untuk membetulkan kecacatan genetik tisu stromal. Ia sepatutnya bahawa sel-sel leluhur mesenchymal tidak lama lagi akan digunakan dalam neurologi untuk sel-sel otak chimerization arah dan mewujudkan satu kumpulan sel-sel sihat, mampu menjana enzim kekurangan atau faktor yang bertanggungjawab bagi manifestasi klinikal penyakit ini. The pemindahan sel stem mesenchymal boleh digunakan untuk memulihkan tulang sumsum stroma pada pesakit kanser selepas radioterapi dan kemoterapi, dan dalam kombinasi dengan sel-sel sum-sum tulang - untuk pemulihan hematopoiesis. Pembangunan terapi penggantian yang bertujuan untuk menghapuskan kecacatan sistem otot menggunakan MSC menggalakkan kejuruteraan dalam biobahan reka bentuk matriks atau biomimics membentuk rangka menduduki keturunan sel-sel stem mesenchymal.

Sumber sel stem mesenchymal

Sumber utama sel stem mesenchymal adalah sumsum tulang sel-sel stem hematopoietik yang pada mamalia sentiasa membezakan ke dalam sel-sel darah dan sistem imun, manakala sel-sel stem mesenchymal dibentangkan populasi kecil sel-sel stromal sumsum tulang fibroblast-suka dan membantu mengekalkan keadaan dibezakan daripada sel stem hematopoietic. Di bawah keadaan tertentu, sel stem mesenchymal membezakan sel-sel tisu cartilaginous dan tulang. Apabila bersalut pada medium budaya dalam sel-sel sum-sum tulang mononuklear stromal penanaman berkepadatan rendah membentuk koloni sel pengikut, yang, sebenarnya, adalah fibroblast multipotent sel pelopor mesenchymal. Beberapa penulis telah mencadangkan bahawa sumsum tulang didepositkan sel mesenchymal stem tidak komited, yang, terima kasih kepada keupayaan untuk diri-memperbaharui dan potensi pembezaan tinggi, menyediakan semua tisu badan yang terdahulu sel mesenchymal stromal sepanjang hidup organisma mamalia.

Dalam sumsum tulang, unsur-unsur sel stromal membentuk rangkaian yang mengisi ruang antara sinusoid dan tisu tulang. Kandungan MSC tidak aktif dalam sumsum tulang orang dewasa adalah setanding dengan jumlah sel stem hematopoietik dan tidak melebihi 0.01-0.001%. Sel stem Mesenchymal yang diasingkan daripada sumsum tulang dan tidak tertakluk kepada penanaman tidak mempunyai molekul pelekat. MSC tersebut tidak menyatakan CD34, ICAM, VCAM, jenis I dan III kolagen, CD44 dan CD29. Oleh itu, dalam vitro sel-sel stem mesenchymal tidak tetap pada substrat budaya, dan leluhur yang diperolehi sel mesenchymal stem yang lebih maju, telah membentuk komponen cytoskeletal dan peralatan reseptor molekul lekatan sel. Sel stromal dengan fenotip CD34 didapati walaupun dalam darah periferal, walaupun mereka jauh lebih rendah dalam sumsum tulang daripada sel mononuklear positif CD34. Sel CD34 diasingkan dari darah dan dipindahkan ke dalam budaya melekat pada substrat dan membentuk koloni sel seperti fibroblast.

Telah diketahui bahawa dalam tempoh embrionik pangkalan stromal semua organ dan tisu mamalia dan manusia timbul dari kumpulan sel mesenchymal yang biasa sebelum dan pada tahap organogenesis. Oleh itu, dipercayai bahawa dalam badan yang matang, kebanyakan sel stem mesenchymal harus berada dalam tisu penghubung dan tulang. Telah terbukti bahawa majoriti unsur-unsur sel stroma penyambung longgar dan tisu tulang diwakili oleh sel-sel progenitor yang komited, namun, mengekalkan keupayaan untuk membiak dan membentuk klon secara in vitro. Dengan pengenalan sel-sel tersebut ke dalam jumlah aliran darah, lebih daripada 20% sel progenitor mesenchymal ditanamkan di antara unsur-unsur stromal dari tisu hematopoietik dan organ parenchymal.

Satu sumber potensi sel stem mesenchymal adalah tisu adipos, antaranya sel stem komited dijumpai di dalam pelbagai peringkat leluhur sel lemak. Elemen leluhur kurangnya matang tisu adipos - sel-sel stromal-vaskular, yang adalah sama seperti leluhur mesenchymal multipotent sumsum tulang boleh membezakan ke dalam adipocytes bawah tindakan glucocorticoids, faktor pertumbuhan seperti insulin dan insulin. Dalam budaya sel vaskular stromal membezakan ke dalam adipocytes dan kondrosit dan sel-sel sumsum yang diperolehi tulang tisu adipos sedang membentuk adipocytes dan osteoblas.

Di dalam otot, punca stromal juga didapati. Sel-sel budaya utama diasingkan daripada otot rangka manusia, mendedahkan sel-sel berbentuk bintang dan myotubes multinucleated. Dalam kehadiran sel-sel seperti bintang kuda serum berkembang dalam vitro tanpa tanda-tanda cytodifferentiation dan selepas penambahan dexamethasone untuk medium budaya pembezaan dicirikan oleh kemunculan sel unsur-unsur sel dengan phenotype otot rangka dan licin, tulang, tulang rawan dan tisu adipos. Oleh itu, kedua-dua sel progenitor mesenchymal berbilang dan komplot hadir dalam tisu otot manusia. Ia menunjukkan bahawa penduduk sel-sel leluhur di dalam otot rangka datang dari sum-sum tulang sel-sel mesenchymal leluhur multipotent tidak komited, dan berbeza daripada sel-sel satelit myogenic.

Dalam myocardium tikus yang baru lahir juga mendapati sel-sel seperti bintang pelekat, sesuai untuk potensi pembezaan sel-sel mesenchymal leluhur multipotent, kerana di bawah pengaruh dexamethasone mereka membezakan ke dalam adipocytes, osteoblas, kondrosit, sel-sel otot licin, myotubes otot rangka dan myocytes jantung. Ia telah menunjukkan bahawa vaskular sel-sel otot licin (pericytes) berasal multipotent dibezakan sel pelopor mesenchymal perivascular. Dalam budaya sel-sel stem mesenchymal perivascular daftar a-licin actin otot dan platelet yang diperolehi faktor pertumbuhan reseptor dan dapat membezakan sel-sel otot sekurang-kurangnya lancar.

Tempat khas, dari segi rizab batang, adalah tisu rawan, yang potensi reparatif yang sangat rendah dipercayai disebabkan oleh kekurangan sel progenitor mesenchymal multipoten atau faktor pembezaan dan pertumbuhan. Diandaikan bahawa sel progenitor mesenchymal multipot yang telah disumbangkan kepada chondro- dan osteogenesis memasuki tisu kartilaginus dari sumber tisu lain.

Asal tisu dan keadaan komitmen sel leluhur mesenchymal dalam tendon juga belum ditubuhkan. Ekspermentalnye pemerhatian mencadangkan bahawa dalam sel-sel tendon Achilles arnab selepas bersalin awal dalam budaya utama dalam petikan pertama dan mengekalkan ungkapan jenis kolagen I dan decorin, tetapi apabila pengkulturan lagi mereka kehilangan tenotsitov penanda pembezaan.

Perlu diingatkan bahawa jawapan kepada soalan sama ada memang setempat dalam pelbagai tisu sel-sel leluhur mesenchymal multipotent sentiasa hadir dalam stroma mereka atau kolam tisu sel-sel stem mesenchymal adalah diimbangi oleh penghijrahan sel-sel sum-sum stem stromal tulang, ia masih ditunggu-tunggu.

Juga sum-sum tulang dan lain-lain mesenchymal zon tisu dewasa lagi sumber MSC mungkin darah tali pusat. Ia telah menunjukkan bahawa pusat darah tali urat mengandungi sel-sel yang mempunyai ciri-ciri morfologi dan antigen sama dengan sel-sel leluhur mesenchymal multipotent mampu melekat, dan tidak lebih rendah multipotent sel mesenchymal leluhur tulang sumsum asal oleh potensi membezakan. Dalam budaya sel stem mesenchymal darah tali pusat dikesan dari 5 hingga 10% tidak komited leluhur mesenchymal multipotent. Ternyata bahawa bilangan mereka dalam darah tali pusat adalah berkadar songsang dengan usia kandungan, yang merupakan bukti tidak langsung penghijrahan sel-sel leluhur mesenchymal multipotent ke dalam pelbagai tisu semasa perkembangan janin. Terdapat maklumat terkini mengenai aplikasi klinikal sel-sel stem mesenchymal diasingkan daripada darah tali pusat, serta embrio diperolehi biomaterial, yang berasaskan kepada keupayaan yang dikenali sel stem janin mengintegrasikan dan fungsi prizhivlyatsya dalam organ-organ dan sistem tisu penerima dewasa.

Mencari sumber baru sel stem mesenchymal

Penggunaan sel stem mesenchymal dari embrio asal, seperti sel janin yang lain, mencetuskan banyak masalah etika, undang-undang, undang-undang dan perundangan. Oleh itu, pencarian bahan penderma selular tambahan berterusan. Percubaan adalah aplikasi klinikal berjaya fibroblas kulit manusia, ia telah ditentukan oleh bukan sahaja kapasiti yang tinggi kewangan teknologi, tetapi juga perbezaan pesat fibrocytes ke dalam fibroblas mempunyai yang kurang berpotensi percambahan dan menghasilkan bilangan yang terhad faktor pertumbuhan. Kemajuan dalam bidang biologi dan MSC adalah sel-sel leluhur sumsum tulang mesenchymal multipotent dibenarkan untuk membangunkan strategi untuk penggunaan klinikal sel stem mesenchymal autologous. Teknologi pengasingan, penanaman, pembiakan mantan vivo dan pembezaan yang diarahkan diperlukan, pertama sekali, kajian spektrum penanda MSCs. Analisis mereka menunjukkan bahawa dalam budaya utama tisu tulang manusia terdapat beberapa jenis sel progenitor mesenchymal multipoten. Proosteoblastov phenotype dijumpai di dalam sel-sel menyatakan sel-sel leluhur penanda STRO-1 stromal, tetapi tidak membawa penanda osteoblast - phosphatase alkali. Sel-sel tersebut mempunyai ciri-ciri keupayaan yang rendah untuk membentuk matriks tulang galian, serta kekurangan ungkapan osteopontin dan paratiroid reseptor hormon. Derivatif sel STRO-1-positif yang tidak mengekspresikan fosfatase alkali diwakili oleh osteoblas yang menengah dan sepenuhnya dibezakan. Ia telah mendapati bahawa unsur-unsur sel garisan klon STRO-1 sel-sel positif tulang trabekular manusia mampu membezakan ke dalam osteocytes matang dan adipocytes. Pembezaan arah sel-sel ini bergantung kepada pendedahan asid politaktepu lemak, cytokines proinflammatory - IL-1b dan faktor nekrosis tumor yang (TNF-a), dan juga anti-radang dan imunosupresif TGF-b.

Kemudian didapati bahawa multipotent sel pelopor mesenchymal kekurangan tertentu sahaja kepada mereka phenotype yang wujud, tetapi daftar penanda kompleks, ciri bagi mesenchymal, endothelial, sel-sel epitelium dan otot dalam ketiadaan ungkapan sel hematopoietic antigen immunophenotypic - CD45, CD34 dan CD14. Di samping itu, sel-sel stem mesenchymal dan constitutively inducibly menghasilkan hematopoietic dan faktor-faktor pertumbuhan bukan hematopoietik, interleukin dan chemokines, dan dalam sel-sel pelopor mesenchymal multipotent dinyatakan reseptor untuk beberapa faktor-faktor pertumbuhan dan sitokin. Antara sel-sel stromal asas-asas tubuh manusia mendapati sel-sel dormantnye atau berehat dengan immunophenotype, hampir sama dengan profil antigen sel leluhur mesenchymal multipotent 5-fluorourasil mentah - mereka dan sel lain menyatakan CD117, menandakan "dewasa" sel stem.

Oleh itu, penanda sel yang unik untuk sel stem mesenchymal masih belum ditubuhkan. Ia adalah dianggap bahawa sel-sel berehat adalah penduduk tidak komited sel pelopor mesenchymal multipotent kerana mereka tidak menyatakan penanda sel komited untuk osteoarthritis (CBFA-1) atau adipogenesis (PPAR-y-2). Pendedahan berpanjangan berehat sel perlahan-lahan membiak dengan keputusan anak lembu serum janin dalam pembentukan prekursor komited maut berbeza, yang disifatkan oleh pertumbuhan yang pesat. Pertumbuhan klon sel mesenchymal batang tersebut disokong oleh FGF2. Nampaknya bahawa sel-sel stem stromal genom yang diperolehi "tertutup" cukup ketat telah dilaporkan mengenai ketiadaan pembezaan spontan dalam MSC -. Tanpa syarat khas kerana melakukan walaupun mereka tidak ditukar ke dalam sel-sel siri mesenchymal.

Mengkaji struktur penduduk yang diperoleh mesenchymal sel-sel stem yang dicari protein pembezaan penanda pada bahagian-bahagian sel stromal dan budaya utama. Di tanah jajahan assay sel-sel sum-sum tulang klon in vitro mendapati bahawa apabila tertakluk kepada budaya utama EGF meningkatkan saiz purata jajahan dan mengurangkan ungkapan klon phosphatase alkali, manakala penambahan hydrocortisone mengaktifkan ungkapan phosphatase alkali yang merupakan penanda pembezaan osteogenic daripada MSCs orientasi. Antibodi monoklonal terhadap STRO-1 memungkinkan untuk memisahkan dan populasi kajian sel pengikut STRO-1-positif dalam sistem heterogen budaya Dexter. Spektrum cytokines tidak mengawal selia hanya percambahan dan pembezaan sel-sel hematopoietic dan limfoid, tetapi juga mengambil bahagian dalam pembentukan, pembentukan dan penyerapan semula tisu rangka oleh para-, auto- dan mekanisme endokrin. Pelepasan reseptor-pengantara utusan menengah seperti kem, diacylglycerol, inositol trifosfat, dan Ca2 + juga digunakan untuk analisis penanda kategori yang berlainan bagi tisu stromal sel menyatakan reseptor berkaitan. Penggunaan antibodi monoklonal sebagai penanda dibenarkan untuk menubuhkan stromal organ limfoid milik sel reticular untuk T dan zon B-bergantung.

Selama beberapa waktu perselisihan saintifik terus membahas persoalan kemungkinan asal MSC dari sel stem hematopoietik. Sesungguhnya, dengan penggantungan penggantungan sel-sel sum-sum tulang ke dalam budaya monolayer, koloni fibrosblis diskrit tumbuh di dalamnya. Walau bagaimanapun, ia telah menunjukkan bahawa kehadiran prekursor koloni fibroblast dan pelbagai kuman pembezaan tisu hematopoietik sebagai sebahagian daripada sum-sum tulang bukan bukti asal bersama mereka sel-sel stem hematopoietic. Menggunakan analisis diskriminan sel-sel sum-sum tulang didapati bahawa mikro pada pemindahan heterotopic, sel-sel hematopoietic sumsum tulang dipindahkan, yang membuktikan kewujudan, dalam sumsum tulang bebas daripada histogenetic MSC penduduk sel hematopoietic.

Di samping itu, kaedah pengklonan terpilih mendedahkan dalam budaya monolayer sel stromal sumsum tulang dari satu kategori baru sel-sel pelopor untuk menentukan bilangan mereka, untuk mengkaji sifat-sifat, potensi proliferatif dan perbezaan mereka. Ia telah mendapati bahawa dalam vitro fibroblast-seperti sel-sel stromal membiak dan membentuk koloni diploid bahawa apabila pemindahan terbalik ke dalam badan memastikan pembentukan organ pembentuk darah baru. Keputusan kajian klon individu menunjukkan bahawa terdapat penduduk sel dalam potensi proliferatif dan perbezaan mereka dapat menuntut peranan sel-sel stem tisu stromal yang, Gistogeneticheskaja bebas daripada sel-sel stem hematopoietic dalam sel-sel stromal leluhur. Sel-sel daripada penduduk ini dicirikan oleh pertumbuhan berdikari leluhur dan sel dibezakan unsur-unsur tulang, tulang rawan dan tisu reticular sumsum tulang.

Kepentingan besar adalah hasil kajian Chailakhyan R. Et al (1997-2001), yang tulang berbudaya sumsum yang diperolehi stromal leluhur sel arnab, guinea pigs, dan tikus daripada a-MEM budaya sederhana ditambah dengan janin anak lembu serum. Penulis Explantation dijalankan dengan kepadatan awal 2-4 x 103 sel-sel sum-sum setiap 1 cm2. Sebagai homolog digunakan feeder atau heterologus dilemahkan oleh penyinaran sel-sel sum-sum tulang dalam tindakan penahan dos feeder, tetapi percambahan tersumbat sepenuhnya. Dua minggu jajahan diskret utama telah trypsinized fibroblas untuk menghasilkan strain monoklonal. Bukti jajahan asal klon telah diperolehi dengan menggunakan penanda kromosom dalam budaya campuran sumsum tulang lelaki dan perempuan guinea babi, menembak masa berlalu kultur hidup, serta dalam budaya campuran sumsum tulang tikus syngeneic dan CBA SVAT6T6. Pemindahan buburan sel-sel sum-sum tulang yang baru diasingkan ditanam di vitro atau stromal fibroblas bawah kapsul buah pinggang dijalankan di ivalonovyh perancah berliang atau gelatin, serta arnab dilemahkan tulang cancellous matriks. Pemindahan klon ke dalam sampul tulang paha guinea babi dibersihkan dari tisu lembut dan periosteum, potong epiphysis dan teliti mencuci sumsum tulang mereka. Tulang dipotong kepada serpihan (3-5 mm), kering dan sinaran dalam dos 60 Gy. Di dalam selaput tebal, koloni fibroblast individu diletakkan dan ditanam intramuskular. Untuk pemindahan intraperitoneal fibroblas stromal, ditanam di vitro, kami menggunakan jenis Kebuk penyebaran (V = 0015 cm 3, h = 0, l mm) dan D (V = 0,15 cm 3, h = 2 mm).

Ketika mengkaji dinamik pertumbuhan strain klon Chailakhyan R. Et al (2001) mendapati bahawa sel-sel individu, tanah jajahan membentuk fibroblas, serta keturunan mereka mempunyai potensi proliferatif yang besar. Mengikut laluan ke-10, jumlah fibroblas dalam sesetengah strain adalah 1.2-7.2 x 10 ⁹ sel. Dalam proses pembangunan mereka, mereka membuat liputan sel 31-34. Pemindahan itu heterotopic tulang strain sumsum yang diperolehi dibentuk oleh prekursor stromal beberapa klon dozen membawa kepada pemindahan mikro sumsum tulang dan pendidikan dalam pemindahan organ zon hematopoietic baru. Penulis menimbulkan persoalan sama ada klon individu boleh bertolak ansur dengan sel-sel tulang sumsum mikro stromal, atau ia memerlukan kerjasama daripada beberapa yang berbeza stromal leluhur clonogenic? Dan jika klon individu akan dapat memindahkan mikro, sama ada ia penuh dengan ketiga-tiga darah kuman, atau klon yang berbeza memberikan pembentukan mikro hematopoietic kuman yang berbeza? Untuk menangani isu-isu ini telah teknologi sel leluhur penanaman stromal dibangunkan dalam gel kolagen yang membolehkan anda untuk menembak dari permukaan fibroblas jajahan untuk pemindahan heterotopic berikutnya berkembang. Klon individu fibroblas stromal, sel-sel sum-sum tulang berkembang daripada tikus CBA dan babi guinea, dipotong bersama-sama dengan serpihan kot gel dan heterotopic dipindahkan - di bawah kapsul buah pinggang tikus syngeneic atau autologous perut otot babi guinea. Apabila transplantasi ke dalam otot, koloni pada gel diletakkan di dalam penutup tulang.

Kami mendapati bahawa dengan 50-90 hari selepas pemindahan sumsum tulang fibroblast koloni dalam 20% daripada kes-kes yang diperhatikan dalam pembangunan kawasan pemindahan tulang atau tulang dan tisu hematopoietik. Dalam 5% haiwan penerima, tulang tompok tulang yang terbentuk mengandungi rongga yang dipenuhi dengan sumsum tulang. Di dalam silinder tulang tumpuan itu mempunyai bentuk yang bulat dan kapsul dibina daripada tisu tulang, dengan osteocytes dan lapisan osteoblastic yang maju. Rongga sumsum tulang mengandungi kain reticular dengan mieloid dan Erythroid sel-sel, bahagian yang tidak berbeza daripada yang dalam sum-sum tulang normal. The rasuah buah pinggang adalah sebuah badan yang berkenaan dgn sumsum biasa dibentuk oleh native speakers pemindahan sum-sum tulang, di mana kapsul tulang hanya meliputi rongga berkenaan dgn sumsum dari kapsul renal. Tisu berkerudung termasuk unsur myeloid, erythroid dan megakaryocytic. Stroma rongga medullary mempunyai sistem sinus yang maju dan mengandungi sel lemak tipikal. Pada masa yang sama dalam bidang pemindahan beberapa jajahan tulang tanpa tanda-tanda hematopoiesis didapati di bawah kapsul buah pinggang. Kajian potensi proliferatif dan pembezaan klon individu diteruskan pada strain sumsum tulang arnab monoklonal, sel-sel resuspended dalam medium budaya dan dalam span ivalonovoy yang berasingan seberat 1-2 mg terletak di bawah kapsul buah pinggang daripada tulang arnab sumsum penderma. Autotransplantasi sedemikian tertakluk kepada sel-sel 21 strain monoklonal. Hasilnya diambil kira dalam 2-3 bulan. Penulis mendapati bahawa 14% daripada tulang sumsum strain monoklonal dipindahkan badan dibentuk terdiri daripada tulang dan sumsum tulang rongga diisi dengan sel-sel hematopoietic. Dalam 33% daripada kes-kes tekanan yang dipindahkan membentuk tulang padat dengan rongga saiz yang berbeza ostootsitami bata dalam osteoblastic dan lapisan maju. Dalam sesetengah kes, dalam spons dengan klon yang ditransplantasikan, tisu retikular dikembangkan tanpa unsur-unsur tulang atau hemopoietik. Kadang-kadang, stroma retikular terbentuk dengan rangkaian sinusoid yang maju, tetapi tidak dihuni oleh sel-sel hematopoietik. Oleh itu, keputusan yang diperoleh adalah serupa dengan yang diperolehi dalam pemindahan klon pada gel kolagen. Walau bagaimanapun, jika pemindahan klon yang ditanam di atas substrat menyebabkan pembentukan tisu sum-sum adalah 5% daripada tulang - 15% dan kain reticular - dalam 80% kes, monoklonal pemindahan yang strain pembentukan sel-sel sum-sum tulang diperhatikan dalam 14% daripada kes-kes tulang - dalam 53% dan reticular - dalam 53% kes. Menurut pengarang, ini menunjukkan bahawa syarat-syarat bagi pelaksanaan potensi proliferatif dan pembezaan fibroblas stromal apabila dipindahkan ke perancah berliang lebih optimum daripada dengan pemindahan mereka dalam tulang dan meliputi substrat kolagen. Ia tidak dikecualikan bahawa penggunaan kaedah yang lebih maju penanaman dan pemindahan maklum balas klon boleh memperbaiki keadaan bagi pelaksanaan klon potensi perbezaan dan mengubah hubungan-hubungan ini. Satu cara atau lain, tetapi nilai utama kajian ini terletak pada hakikat bahawa beberapa klon sel stromal mampu membentuk tisu tulang di samping memastikan mikro hematopoietic stromal segera selama tiga pucuk darah sumsum tulang: Erythroid, mieloid dan megakaryocytic, mewujudkan cukup besar tapak perniagaan tisu hematopoietik dan beberapa jisim tulang.

Tambahan pula, penulis menyelesaikan masalah keupayaan untuk jenis pembezaan sel diberikan sel induk stromal stigma individu dalam keadaan sistem tertutup ruang penyebaran. Tambahan pula, ia adalah perlu untuk menentukan sama ada klon individu pameran pluripotent atau mempamerkan untuk potensi membezakan memerlukan interaksi koperasi daripada beberapa klon dengan tanda cytodifferentiation tetap, nisbah yang berbeza yang menentukan pembentukan keutamaan tulang, tulang rawan atau reticular. Dengan menggabungkan dua pendekatan metodologi - monoklonal mengasingkan sel-sel leluhur sumsum stromal tulang dan pemindahan mereka ke dalam dewan penyebaran, Chailakhyan R. Et al (2001) yang diperolehi hasil yang dibenarkan untuk mendekati pemahaman organisasi struktur stroma sumsum tulang. Pemindahan strain monoklonal sel-sel leluhur stromal ke dalam sel-sel O jenis mengakibatkan pembentukan kedua-dua tulang dan rawan tisu, menunjukkan keupayaan keturunan satu sel stromal koloni-membentuk pada masa yang sama membentuk tulang dan tulang rawan. Anggapan bahawa tisu tulang dan tulang kartilaginus berasal dari sel progenitor stroma biasa telah berulang kali dinyatakan dengan berulang kali. Walau bagaimanapun, hipotesis ini tidak mempunyai pengesahan percubaan yang betul. Tulang dan pembentukan tulang rawan di dalam kamar penyebaran adalah perlu untuk membuktikan kewujudan sel-sel stem termasuk tulang sel-sel sum-sum stromal pelopor biasa untuk kedua-dua jenis tisu.

Kemudian, 29 strain klonal dari petikan kedua dan ketiga yang diperoleh dari budaya utama sumsum arnab diletakkan di dalam ruang penyebaran dan ditanam intraperitoneally dengan haiwan homologous. Kajian telah menunjukkan bahawa 45% daripada keturunan monoklonal sumsum tulang mempunyai potensi osteogenic. Secara kebetulan, tisu retikular mengandungi 9 ruang, tetapi bersama-sama dengan tisu tulang dan kartilaginus terdapat dalam 13 bilik lebih, yang menyumbang 76% daripada semua jenis. Dalam bilik jenis O, di mana pembezaan mungkin untuk kedua-dua tisu tulang dan kartilaginus, 16 strain dikaji. Dalam empat ruang (25%), kedua-dua tisu tulang dan tulang kartilaginus terbentuk. Sekali lagi harus diperhatikan bahawa kajian Chailakhyan R. Et al (2001) sel-sel leluhur individu menjalani ketegangan sel yang terdiri daripada 31-34 doublings, dan keturunan mereka adalah 0,9-2,0 × 10 ⁹ sel. Bilangan mitos yang mana sel-sel prekursor strain poliklonal terdedah hampir sama dengan sel-sel strain monoklonal. Pada masa yang sama, kadar perkembangan strain poliklonal, terutamanya dalam fasa pertama pembentukannya, bergantung kepada banyaknya koloni yang digunakan untuk memulakan strain. Penyakit fibroblast embrio manusia (WI-38) yang dibentuk semula pada tahap 12-15 pendua juga membentuk koloni yang berbeza dalam diameter dan kandungan sel di dalamnya. Koloni besar yang mengandungi lebih daripada 103 sel hanya 5-10%. Dengan peningkatan bilangan bahagian, peratusan koloni besar menurun. Alunan fibroblast sumsum tulang stromal mono dan polyclonal mengekalkan kromosom diploid ditetapkan selepas 20 atau lebih doublings, dan kecenderungan pembangunan setanding dengan dinamik strain diploid fibroblas embrio. Analisis potensi pembezaan sel-sel stromal leluhur sumsum tulang tertentu, yang dijalankan oleh strain monoklonal pemindahan dalam kamar penyebaran, menunjukkan bahawa separuh daripada mereka osteogenic. Tanah jajahan besar menyumbang 10% daripada jumlah keseluruhan mereka. Akibatnya, bilangan pembentuk koloni osteogenik bersamaan dengan kira-kira 5% daripada jumlah penduduknya. Dalam jumlah jisim sel-sel progenitor osteogenik yang dikenal pasti oleh penulis, terdapat sel-sel yang mampu membentuk tisu tulang dan kartilaginus serentak. Buat pertama kali ia mendapati bahawa bagi kedua-dua jenis tisu dalam organisma dewasa adalah sel pelopor yang sama: 25% daripada klon yang diuji dicipta oleh sel-sel yang serupa, dan bilangan mereka dalam populasi umum sel leluhur tidak kurang daripada 2.5%.

Oleh itu, pemindahan heterotopik klon individu fibroblas sumsum tulang telah membuka aspek-aspek baru dalam organisasi struktur populasi sel progenitor mesenchymal. Mendapati sel-sel stromal leluhur mampu memindahkan mikro tertentu dengan segera untuk semua stem hemopoietic mana bilangan antara klon yang disiasat lebih besar pada model yang berbeza adalah dari 5 hingga 15% (0.5-1.5% daripada jumlah bilangan sel-sel leluhur dikesan). Bersama-sama dengan klon, memindahkan lengkap mikro sum-sum tulang, terdapat sel-sel leluhur, berketentuan sahaja untuk pembentukan tulang, yang bentuk apabila dipindahkan ke sistem terbuka, tulang yang tidak menyokong pembangunan hematopoiesis. Jumlah mereka dari jumlah sel progenitor adalah 1.5-3%. Sesetengah sel ini boleh membentuk tisu tulang dengan tempoh penyelenggaraan diri yang terhad. Akibatnya, populasi sel progenitor stromal adalah heterogen dalam potensi pembezaannya. Antaranya terdapat satu kategori sel, mendakwa peranan sel-sel stromal stem mampu membezakan ke dalam ketiga-tiga dimensi yang terdapat dalam tisu tulang sumsum stromal, membentuk tulang, tulang rawan dan tisu reticular. Data-data ini membolehkan kita untuk berharap dengan bantuan pelbagai penanda sel akan menjadi mungkin untuk menentukan sumbangan setiap jenis sel stromal dalam mikro organisasi tertentu dan menyokong hematopoiesis dalam budaya Dexter.

Ciri-ciri sel stem mesenchymal

Dalam tahun-tahun kebelakangan ini, ia mendapati bahawa dalam budaya pegun sumsum tulang mesenchymal sel-sel leluhur multipotent dibentangkan penduduk yang terhad sel agranular kecil (RS-1) sel-sel, ciri-ciri keupayaan rendah penjajahan dan ketiadaan Ki-67 antigen ungkapan khusus untuk membiak sel. Parameter antigen dormantnyh RS-1 sel-sel adalah berbeza daripada spektrum antigen komited cepat membiak sel stromal leluhur. Telah didapati bahawa kadar proliferasi komoditi yang tinggi telah diperhatikan hanya dengan kehadiran sel RS-1. Sebaliknya, RS-1 sel meningkatkan kadar pertumbuhan di bawah pengaruh faktor-faktor yang dirembeskan oleh sel-sel leluhur multipotent mesenchymal diperolehi paling matang. Ia seolah-olah bahawa RS-1 sel-sel adalah subset MSCs tidak komited mampu dikitar semula. Di tahan sel-sel stromal leluhur 5-fluorourasil sumsum tulang dicirikan oleh kandungan RNA yang rendah dan tahap ekspresi gen decarboxylase ornithine vitro - penanda bukan membiak sel.

Intensive sel-sel leluhur pembiakan stromal bermula selepas penetapan mereka pada substrat. Apabila ini profil dinyatakan penanda sel buruk dibezakan: SH2 (TGF- reseptor (3), SH3 (domain isyarat protein), jenis kolagen I dan III, fibronectin, melekat reseptor VCAM-1 (CD106) dan ICAM (CD54), cadherin-11 , CD44, CD71 (transferrin reseptor), CD90, CD120a dan CD124, tetapi tanpa ungkapan penanda ciri sel stem hematopoietik (CD34, CD14, CD45). Pertumbuhan klon membolehkan berulang kali passaged sel-sel stem mesenchymal untuk menghasilkan budaya banyak genetik homogen stromal leluhur pluripotent sel. 2-3 peredaran bilangan mereka mencapai 50-300,000,000. Dalam budaya ketumpatan mencukupi selepas berhenti pembiakan sel-sel stromal leluhur, tidak seperti fibroblas tisu hematopoietik membezakan ke dalam adipocytes, myocytes, sel-sel rawan, dan tisu tulang. Gabungan tiga pembezaan isyarat kawal selia yang terdiri daripada 1-methyl-izobutilksantin (pencetus pembentukan kem intrasel), dexamethasone (perencat phospholipase dan C) dan indomethacin (perencat cyclooxygenase, thromboxane aktiviti menurunkan dan) bertukar dalam Sel lemak dan 95% sel-sel mesenchymal leluhur. Pembentukan sel lemak dari sel-sel stromal tidak matang disahkan ungkapan gen lipoprotein lipase, pengenalan histochemical daripada apolipoproteins dan reseptor peroxysomal. Sel-sel klon yang sama dipengaruhi oleh TGF-b dalam serum medium percuma mewujudkan penduduk homogen kondrosit. Budaya sel pelbagai lapisan rawan matriks extracellular dicirikan dibangunkan terdiri daripada proteoglikan dan kolagen jenis II. The medium nutrien dengan 10% serum janin isyarat kesan pembezaan kompleks yang terdiri daripada b-glycerophosphate (donator fosfat bukan organik), asid askorbik dan dexamethasone, dalam budaya stromal sel-sel leluhur leluhur sama membawa kepada pembentukan agregat sel. Dalam sel tersebut, terdapat peningkatan yang progresif dalam aktiviti peringkat phosphatase dan osteopontin alkali, menunjukkan pembentukan mineral tulang yang sel-sel mengesahkan peningkatan progresif dalam kalsium intraselular.

Menurut sesetengah orang, keupayaan sel-sel stem mesenchymal untuk membahagikan selama-lamanya dan pembiakan pelbagai jenis sel keturunan mesenchymal digabungkan dengan ijazah tinggi keplastikan. Apabila diberikan ke dalam ventrikel, atau perkara putih sel-sel stem mesenchymal berhijrah ke dalam parenchyma tisu saraf dan membezakan ke neuron atau glial diperolehi garis sel. Di samping itu, terdapat maklumat tentang MSC transdifferentiation dalam sel-sel stem hematopoietic kedua-dua in vitro dan in vivo. Satu analisis yang lebih terperinci dalam beberapa kajian telah dipilih kemuluran sangat tinggi MSC, yang ditunjukkan dalam keupayaan untuk membezakan ke dalam astrocytes, oligodendrocytes, neuron, cardiomyocytes, sel-sel otot licin dan sel-sel otot rangka. Dalam beberapa kajian transdifferentsirovochnogo potensi MSC in vitro dan in vivo mendapati bahawa sel-sel mesenchymal pelopor multipotent tulang sumsum asal maut membezakan ke dalam bahagian sel yang membentuk tulang, tulang rawan, otot, saraf dan tisu adipos, serta tendon dan stroma yang menyokong hematopoiesis .

Walau bagaimanapun, dalam kajian lain, tiada tanda-tanda sekatan pluripotency genom sel stem mesenchymal dan tidak dapat dikesan populasi sel stromal leluhur, tetapi untuk memeriksa sel-sel stromal pluripotent mungkin disiasat lebih 200 klon MSC diasingkan daripada budaya rendah. Sebahagian besar dalam vitro klon mengekalkan keupayaan untuk membezakan ke osteogenic, chondrogenic dan mendapatkan arahan adipogenic. Apabila tidak termasuk kebarangkalian penghijrahan sel-sel penerima oleh pemindahan sel stem mesenchymal bawah kapsul buah pinggang atau dalam kamar penyebaran ia muncul bahawa sel-sel stromal leluhur in situ mengekalkan phenotype heterogen, yang menunjukkan sama ada ketiadaan zon pemindahan faktor sekatan atau ketiadaan MSC pluripotent sahaja. Pada masa yang sama membenarkan kewujudan jenis yang jarang berlaku sel-sel stem pluripotent somatik, yang prekursor biasa sel-sel stem dewasa.

Pada pelbagai, tetapi tidak benar pluripotent sel-sel stem mesenchymal membentuk bahagian yang kecil sel-sel sum-sum tulang dan mampu, dalam keadaan tertentu, apabila berbudaya dalam vitro untuk berkembang tanpa datang ke dalam pembezaan, seperti yang dibuktikan oleh komitmen keturunan mereka disebabkan sel-sel di dalam tulang, tulang rawan, lemak, tisu otot , serta dalam tenosit dan unsur stromal yang menyokong hematopoiesis. Biasanya, pendedahan berterusan dalam medium budaya dengan janin anak lembu serum menimbulkan MSC output dalam stromal sel leluhur komited, keturunan yang melalui pembezaan akhir spontan. In vitro mungkin untuk mencapai pembentukan osteoblast arah dengan menambah kepada medium pendingin dexamethasone, ß-glycerophosphate dan askorbik asid, manakala kombinasi pembezaan isyarat dexamethasone dan insulin mendorong pembentukan adipocytes.

Ditubuhkan bahawa sebelum memasuki peringkat pembezaan terminal sumsum tulang MSC untuk mewujudkan keadaan budaya tertentu mulanya membezakan ke dalam sel-sel mesenchymal stem fibroblast-suka. Derivatif sel-sel dalam vivo yang terlibat dalam pembentukan tulang, tulang rawan, tendon, lemak dan tisu otot serta sokongan stromal hematopoiesis. Ramai penulis memahami "sel-sel leluhur mesenchymal multipotent" istilah yang sebenarnya MSC, dan komited sel stromal leluhur dan tisu mesenchymal sumsum tulang. Analisis klon sel leluhur multipotent mesenchymal asal sumsum tulang menunjukkan lebih daripada satu pertiga daripada klon dibezakan dalam osteo-, hondro- dan adipocytes, manakala sel-sel klon lain mempunyai osteogenic berpotensi dan bentuk yang hanya hondro- dan osteocytes. Ini klon sel pelopor mesenchymal multipotent sebagai IUD-9, di bawah keadaan yang sesuai mikro dibezakan ke dalam sel-sel dengan phenotype dan berfungsi bukanlah hanya tertumpu kepada osteoblas, kondrosit dan potsitov adic tetapi sel-sel stromal yang menyokong hematopoiesis. Diasingkan daripada sel-sel sum-sum tulang tikus janin mengklon RCJ3.1 dibezakan sel mesenchymal fenotip berbeza. Oleh tindakan gabungan asid askorbik, b-glycerophosphate dan dexamethasone dari unsur-unsur sel klon ini mula-mula ditubuhkan myocytes multinucleated dan kemudian, berturut-turut, adipocytes, kondrosit dan pulau kecil tulang galian. Penduduk sel berbutir dari periosteum janin tikus sepadan dengan sel-sel leluhur mesenchymal multipotent tidak komited, kerana ciri-ciri kadar yang rendah percambahan, tidak menyatakan penanda pembezaan, dan dibezakan dalam keadaan budaya untuk membentuk hondro-, osteo- dan adipocytes dan sel-sel otot licin.

Oleh itu, ia perlu diiktiraf bahawa persoalan genom plyuri- atau multipotency sel stem mesenchymal masih terbuka, yang seterusnya memberi kesan kepada pembentangan berpotensi pembezaan sel-sel leluhur stromal, yang juga tidak dipasang sepenuhnya.

Uji kaji terbukti dan ciri penting sel-sel stem mesenchymal adalah kemampuan mereka untuk meninggalkan niche tisu dan beredar dalam edaran umum. Untuk mengaktifkan program genetik pembezaan, sel-sel stem yang beredar harus jatuh ke dalam lingkungan mikro yang sesuai. Ia menunjukkan bahawa apabila ditadbir secara sistematik kepada MSC haiwan penerima aliran darah yang tidak matang sel diimplan dalam organ-organ dan tisu-tisu yang berbeza, maka dibezakan ke dalam darah sel-sel, myocytes, adipocytes, kondrosit, dan fibroblas. Oleh itu, di kawasan tisu tempatan berlaku interaksi Signal selia sel stromal leluhur komited dan tidak komited, dan juga di antara mereka dan sel-sel matang sekitar. Ia adalah dianggap bahawa induksi pembezaan tersebut dibawa faktor paracrine peraturan asal mesenchymal dan nemezenhimalnogo (faktor pertumbuhan, eicosanoids, molekul matriks extracellular) yang menyediakan hubungan ruang dan masa dalam mikro leluhur mesenchymal multipotential. Oleh itu, kerosakan tempatan tisu mesenchymal seharusnya membawa kepada pembentukan zon mikro multipotent sel pelopor mesenchymal berbeza secara kualitatif daripada isyarat peraturan kompleks tisu utuh di mana proses fisiologi berlaku dan bukannya pertumbuhan semula reparative. Perbezaan ini sangat penting dari segi pengkhususan fenotip sel dalam lingkungan mikro dan kerosakan yang disebabkan oleh kerosakan.

Menurut idea-idea, di sini bahawa mekanisme perbezaan asas dua proses yang diketahui - penjanaan fisiologi dan proliferasi keradangan - diletakkan. Yang pertama di antaranya berakhir dengan pemulihan komposisi tisu selular khusus dan fungsinya, sedangkan hasil proses percambahan adalah pembentukan unsur tisu penghubung yang matang dan kehilangan fungsi zon tisu yang rosak. Oleh itu, untuk membangunkan program-program aplikasi yang optimum sel-sel leluhur mesenchymal multipotent dalam perubatan regeneratif dan plastik memerlukan kajian yang teliti keunikan faktor mikro pengaruh ke atas pembezaan MSC.

Pergantungan petak struktur sel stem daripada para- sel dan pengawal selia autocrine yang bersuara adalah termodulat oleh isyarat luaran, yang tidak mempunyai orang tanpa sebarang keraguan. Antara fungsi yang paling penting faktor kawal selia adalah kawalan MSC bahagian simetri dan ungkapan gen menentukan komitmen keturunan langkah dan jumlah pembahagian sel. Isyarat luaran, yang mana perkembangan selanjutnya dari MSC bergantung, disediakan oleh lingkungan mikro mereka. Dalam MSC yang tidak matang untuk berkembang masa yang cukup panjang, di samping mengekalkan keupayaan untuk membezakan ke dalam adipocytes line, myofibroblasts, tisu stromal hematogenous, sel-sel rawan, dan tulang. Ia didapati bahawa penduduk yang terhad beredar unsur-unsur sel stromal SB34-negatif daripada edaran umum itu dikembalikan kepada tisu stroma sum-sum tulang, berubah menjadi garis di mana CD34 positif sel-sel stem hematopoietic. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa sel-sel mesenchymal edaran semula leluhur dalam aliran darah tisu menyediakan sokongan untuk baki sel-sel stem stromal dalam organ-organ yang berbeza dengan menggerakkan kolam biasa sel-sel sum-sum tulang stromal tidak matang. Pembezaan MSC ke dalam sel dengan pelbagai fenotip mesenchymal dan penyertaan mereka dalam pembaikan atau pertumbuhan semula tulang, tulang rawan, tendon dan tisu adipos dalam vivo ditunjukkan oleh model pemindahan angkat dalam haiwan kajian. Menurut pengarang lain, penghijrahan jauh MSC katil vaskular digabungkan dengan anjakan tempatan atau sel-sel mesenchymal pelopor multipotent korotkodistantnym dalam tisu di rawan pembaikan, pertumbuhan semula otot, dan tindak balas pengurangan lain.

Rizab tempatan batang stromal asas tisu bermain sumber peranan sel dalam fisiologi proses pertumbuhan semula tisu dan diisi semula oleh MSC pengangkutan jauh perbelanjaan stromal sumber tisu batang. Walau bagaimanapun, memerlukan penggemblengan kecemasan kapasiti reparative selular, seperti trauma, dalam proses-proses pembaikan pertumbuhan semula menyertai keseluruhan kereta api MSC, dan pinggir melalui saluran darah diambil sel pelopor mesenchymal sumsum tulang.

Pemindahan sel stem mesenchymal

Dikesan beberapa persamaan antara proses fisiologi pertumbuhan semula tisu dan pembentukan semasa perkembangan janin. The embriogenesis manusia dan mamalia, pembentukan pelbagai jenis sel khusus yang diperolehi daripada Ecto, meso dan endodermal kuman lapisan renang, tetapi dengan penyertaan wajib mesenchyme itu. Rangkaian sel longgar tisu mesenchymal janin melakukan banyak peraturan, metabolik, rangka dan fungsi morphogenetic. Bookmark badan yg dilaksanakan dgn bersyarat dijalankan hanya selepas mesenchyme pemeluwapan dengan mengorbankan pertumbuhan clonogenic sel-sel leluhur yang menjana utama isyarat morphogenetic organogenesis. Stromal diperolehi mesenchyme embrio mewujudkan scaffold badan yg dilaksanakan dgn bersyarat dan menjadi asas kepada masa depan energoplasticheskogo memastikan disebabkan oleh pertumbuhan vaskular utama dan saluran limfa. Dalam erti kata lain, unsur-unsur stromal unit peredaran mikro organ-organ janin membangunkan sebelum pembentukan unit struktur dan berfungsi. Di samping itu, penghijrahan aktif sel mesenchymal semasa organogenesis menyediakan orientasi ruang membangunkan organ kerana menandakan sempadan mereka dengan jumlah Sekatan homeotic Hox-tepov. Pada stromal rangka berlaku dan pemasangan unit struktur dan fungsi organ-organ parenchymal, yang selalunya mengandungi morphogenetically dan sel-sel fungsi yang sangat berbeza. Oleh itu, di embriogenesis mesenchyme adalah fungsi utama dan dilaksanakan dengan menjana isyarat peraturan mengaktifkan percambahan leluhur serantau dan pembezaan sel-sel epitelium. Sel mesenchyme embrio menghasilkan faktor pertumbuhan seperti KAKI, HGF-b, CSF, yang mana terdapat sepadan reseptor pada sel-sel parenchymal leluhur. Tisu yang berbeza matang rangkaian sel stromal organisma dewasa juga menjana isyarat untuk mengekalkan daya maju dan pembiakan sel-sel leluhur nemezenhimalnogo asal. Walau bagaimanapun, spektrum stromal isyarat kawal selia dalam selepas bersalin ontogenesis lain (SCF, HGF, IL-6, IL-1, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, GM-CSF, flt-3, LIF, dan lain-lain) dan bertujuan untuk menyediakan penjanaan fisiologi atau pembaikan zon tisu yang rosak. Selain itu, ciri-ciri spektrum faktor pengawalan stromal dalam setiap jenis tisu dan juga dalam organ yang sama adalah berbeza. Khususnya, hematopoiesis dan lymphopoiesis kepada pendaraban dan pembezaan hematopoietic dan sel-sel immunocompetent berlaku hanya dalam organ-organ tertentu, dalam masa yang bertindak stromal mikro menyediakan keadaan untuk kematangan sel hematopoietic dan limfoid. Terpulang kepada faktor kawal selia mikro bergantung kepada keupayaan sel-sel hematopoietic dan limfoid repopulate badan untuk berkembang dan matang menjadi niche mikrostruktur itu.

Antara komponen matriks extracellular, yang menghasilkan sel-sel mesenchymal pelopor multipotent, ia harus diperhatikan fibronectin, laminin, kolagen dan proteoglikan, serta CD44 (hyaluronan dan osteopontin reseptor) menerima bahagian utama dalam organisasi interaksi intercellular dan pembentukan matriks extracellular dalam sumsum tulang dan tulang . Ia membuktikan bahawa sumsum tulang mesenchymal, sel-sel multipotent mewujudkan redshestvenniki stromal mikro, memberikan isyarat induktif dan peraturan bukan sahaja MSC, tetapi juga prekursor hematopoietic dan sel-sel sum-sum stem nemezenhimalnye tulang. Adalah diketahui bahawa MSC terlibat dalam hematopoiesis diukur dengan keupayaan mereka untuk membezakan ke dalam sel-sel stromal yang menyokong hematopoiesis, di mana isyarat MSK bimbingan aktif diperoleh secara langsung daripada sel-sel stem hematopoietic. Itulah sebabnya budaya sel stromal leluhur rangkaian adalah asas untuk memberi makan semua klon sel hematopoietic.

Dalam intensiti organisma matang hemodialisis dan lymphopoiesis dalam keadaan keseimbangan dinamik dengan "expenditure" sel-sel darah matang dan sel-sel sistem imun di pinggir. Kerana sel-sel stromal sumsum tulang dan organ-organ limfoid jarang dikemaskini, ketara struktur penyusunan semula stromal tidak berlaku di dalamnya. Membawa sistem keseimbangan dinamik adalah mungkin dengan bantuan kerosakan mekanikal kepada mana-mana organ hemo atau lymphopoiesis, yang membawa kepada jenis yang sama perubahan berjujukan yang memberi kesan bukan sahaja dan tidak begitu banyak hematopoietic atau limfoid sel-sel, kerana struktur stromal rosak organ. Dalam proses pertumbuhan semula rangka kerja stromal terutamanya dibentuk reparative, yang kemudiannya repopulating hematopoietic atau sel-sel imun. Fakta lama terkenal menjadikan pertumbuhan semula selepas trauma model mudah untuk belajar mikro stromal organ pembentuk darah. Khususnya, untuk siasatan pertumbuhan semula reparative sumsum tulang digunakan mekanikal mengosongkan rongga berkenaan dgn sumsum tulang panjang - pengkuretan, yang membolehkan untuk dengan cepat dan berkesan membawa tisu hematopoietik dari keadaan keseimbangan dinamik. Ketika mengkaji proses pertumbuhan semula reparative daripada hematopoietic dan sumsum stromal tulang komponen selepas pengosongan mekanikal rongga medullar tibia babi guinea mendapati bahawa antara penunjuk pertumbuhan semula sel-sel hematopoietic dan stromal (bilangan sel-sel hematopoietik, kepekatan dan jumlah sel stromal leluhur) tidak ada hubungan langsung. Di samping itu, ia telah mendapati bahawa peningkatan dalam populasi sel-sel leluhur stromal berlaku pada tarikh yang lebih awal selepas pengkuretan, dan mereka sendiri fibroblas stromal adalah fosfatazopolozhitelnymi, yang merupakan ciri tisu osteogenic. Ia juga menetapkan bahawa pengkuretan 3-5 tulang panjang membawa kepada pertumbuhan penduduk sel di dalam sumsum tulang dan tulang bukan dikendalikan walaupun dalam limpa, yang pada babi guinea hanya badan lymphopoietic.

Morfologi proses picture reparative dalam sumsum tulang kyuretirovannyh tibial guinea babi biasanya sepadan dengan data sastera yang diperolehi dalam eksperimen ke atas haiwan spesies lain, dinamik perubahan yang berlaku selepas penyingkiran tisu hematopoietik adalah sama untuk semua spesies dan perbezaan hanya berkaitan parameter masa . Morfologi prosedur fasa bagi mengembalikan hematopoiesis dalam rongga berkenaan dgn sumsum dikosongkan dalam proses berturut-turut menganjurkan pembentukan darah beku tulang serat kasar, penyerapan semula, sudah sinusoids dan reticular pembentukan stroma, yang selanjutnya repopulating elemen hematopoietic. Bilangan sel-sel leluhur hematopoietic dalam sumsum tulang proses pertumbuhan semula tisu kenaikan peningkatan selari dalam kandungan sel-sel stem hematopoietic.

Gerasimov Yu et al (2001) berbanding perubahan dalam bilangan sel hematopoietic dan jumlah prekursor sel stromal dalam fasa individu proses penjanaan semula. Ia telah mendapati bahawa perubahan-perubahan kuantitatif dalam sel-sel sum-sum tulang di kyuretirovannoy tulang perlawanan dinamik ciri-ciri pertumbuhan semula morfologi. Pengurangan dalam tempoh tiga hari pertama kandungan sel dalam penulis tumbuh semula mengaitkan kehilangan sel-sel hematopoietic disebabkan oleh kesan-kesan buruk mikro, yang mencipta tisu reticular tumbuh dalam sum-sum tulang yang tinggal di dalam epiphysis dan dalam kedua untuk membentuk osteoid tumpuan dan kerosakan pembuluh darah dengan pengkuretan. 7-12 hari meningkatkan sel-sel yaderosoderzhaschih th bertepatan dengan kemunculan tumpuan individu dalam mieloid hematopoietic sel stromal zon percambahan. Pada hari ke-20 terdapat sejumlah besar kandungan sumsum semula tulang dan sinus yang maju, yang disertai oleh peningkatan yang ketara dalam jumlah sel. Walau bagaimanapun, bilangan elemen hematopoietik dalam tempoh ini adalah 68% daripada tahap kawalan. Ini adalah selaras dengan data yang diterbitkan sebelum ini menunjukkan bahawa bilangan sel-sel darah-membentuk selepas pengkuretan mencapai piawaian hanya 35-40 hari selepas pembedahan.

Dalam tempoh selepas trauma awal, sumber selular utama untuk memulihkan hemopoiesis adalah unsur selular yang dipelihara dalam kuret. Pada masa akan datang sumber utama pertumbuhan semula sel-sel sum-sum tulang stem hematopoietic adalah tisu, repopulating zon stromal bebas. Berhubung dengan kategori tertentu sel-sel stromal (endothelial, reticular dan osteogenic), sumber untuk pendidikan mereka dalam penyusunan semula rongga berkenaan dgn sumsum, kekal tidak jelas. Keputusan Yu.V. Gerasimova et al (2001) menunjukkan bahawa dalam tulang sumsum yang tinggal selepas kepekatan sel pengkuretan tanah jajahan membentuk fibroblas jauh lebih tinggi daripada dalam sum-sum tulang normal. Penulis percaya bahawa dengan pengkuretan lebih sengit elution terpilih sel hematopoietic berbanding stromal tanah jajahan membentuk sel-sel yang terlibat dalam pembentukan stroma dan lebih tegas berkaitan dengan bahan asas daripada sel-sel hematopoietic.

Dinamik perubahan dalam bilangan sel-sel membentuk jajahan fibroblas ada hubung kait dengan keamatan proses osteogenesis berikutnya trabekular penyerapan semula tulang dan pembentukan reticular stroma yang mengisi sel-sel hematopoietic. Kebanyakan sel progenitor stromal membentuk tisu tulang kasar dan stroma retikular pada masa regenerasi yang ditunjukkan. Untuk patah tulang femoral dalam keadaan osteosynthesis berpanjangan pada hari ke-5 di zon pertumbuhan semula meningkatkan kepekatan sel-sel dan jumlah tanah jajahan membentuk fibroblas, dan pembentukan tulang dalam intensif bilangan mereka meningkat sebanyak 6 kali. Adalah diketahui bahawa sel-sel sum-sum tulang yang membentuk koloni fibroblast mempunyai sifat-sifat osteogenik. Jumlah sel progenitor stromal meningkat sebelum kolonisasi kawasan sumsum tulang korteks dengan sel hematopoietik. Ini adalah dalam persetujuan yang baik dengan bukti bahawa sel stromal memberikan pembentukan lingkungan mikro hematopoietik. Jelas sekali, penciptaan mikro hematopoietic sejajar dengan tahap tertentu pertumbuhan semula tisu stromal, dan meningkatkan bilangan sel-sel hematopoietic atas pengembangan stromal pangkalan sesuai untuk hematopoiesis.

Paling menarik adalah pengarang data bahawa selepas pengkuretan meningkatkan bilangan prekursor sel stromal di kawasan pedalaman tulang. Bermula daripada pukul dua belas, dan pada siang hari kedua puluh termasuk tibia contralateral diperhatikan dalam peningkatan lebih daripada dua kali ganda dalam kepekatan dan jumlah sel-sel membentuk koloni fibroblas. Mekanisme fenomena ini mungkin berkaitan dengan fakta bahawa kecederaan sumsum tulang besar-besaran mengakibatkan pembentukan sejumlah besar darah beku pada masa yang sama memusnahkan sejumlah besar platelet dan pelepasan ke dalam darah faktor pertumbuhan platelet yang diperolehi (RBSK), yang diketahui menyebabkan pembiakan sel-sel membentuk jajahan fibroblas terletak di dalam badan di luar kolam proliferatif. Dalam eksperimen pada arnab pentadbiran tempatan MSC menggalakkan pemulihan rawan pembedahan rosak lutut, yang boleh dikaitkan dengan pembentukan kondrosit diperolehi daripada MSC diperkenalkan. Walau bagaimanapun pertumbuhan semula reparative kecacatan tulang pada tikus makmal meningkat dengan ketara apabila menggunakan sel stem mesenchymal disertakan dalam bingkai seramik. Oleh itu, kita boleh mengandaikan bahawa jika anda tidak RBOK, maka apa-apa faktor lain, berasal dari sel-sel stromal rosak, mempunyai kesan merangsang jauh di pembiakan sel-sel leluhur mesenchymal di tempat utuh sumsum tulang dan merangsang penghijrahan mereka ke kawasan tisu sumsum kecacatan tulang. Sebaliknya, bertentangan ini kepada data sastera tahun-tahun sebelumnya, yang menunjukkan bahawa sel-sel stromal bertanggungjawab mikro, tidak seperti sel-sel hematopoietic tidak dapat berhijrah dan datang dari sumber tempatan.

Walau bagaimanapun, hasil kajian itu Gerasimov Yu et al (2001) mencadangkan bahawa penggunaan trauma mekanikal menyebabkan bukan sahaja penyusunan semula tajam tisu stromal dalam tulang kyuretirovannoy, tetapi juga perubahan ketara dalam tulang jauh stroma utuh, iaitu, terdapat satu tindak balas sistemik tisu stromal untuk trauma tempatan. Dan apabila digunakan polytrauma - pelbagai pengkuretan - tindak balas ini dikuatkan dan diperhatikan bukan sahaja di tulang dikendalikan dan bahagian-bahagian yang jauh daripada tulang, tetapi juga dalam organ-organ limfoid, terutamanya limpa. Mekanisme respon sistemik seperti tisu stroma sumsum tulang dan limpa kepada trauma tempatan dan polytrauma masih tidak diketahui. Diandaikan bahawa proses ini dikaitkan dengan kesan faktor humoral yang dikeluarkan oleh stroma mesenchymal dari rongga medulla sum-sum tulang. Kemungkinan membuat sel-sel stromal sumsum tulang dan limpa organonespetsificheskogo faktor humoral bertanggungjawab percambahan sel, tanah jajahan membentuk fibroblas menunjukkan data mengenai tanah jajahan mereka merangsang aktiviti dalam budaya monolayer sumsum tulang.

Dalam hal ini, ia adalah diperhatikan bahawa apabila diberikan sel pelopor mesenchymal sistemik multipotent repopulating terbitannya bukan sahaja sumsum tulang, tetapi juga tisu-tisu lain, yang digunakan, khususnya untuk terapi gen. Ia menunjukkan bahawa selepas pentadbiran intravena kuantiti yang banyak MSC dengan genom liar jenis tikus dengan sel-sel kolagen mutan gen Saya penderma menggantikan sehingga 30% daripada sel-sel dalam tulang dan rawan tisu penerima, dan mesenchymal sel-sel stem tetikus transfected merembeskan IL-3 manusia, selama 9 bulan berkesan menyokong hematopoiesis dalam kes pentadbiran serentak mereka dengan sel-sel stem hematopoietik manusia ke dalam tikus kelemahan daya imun.

[3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10]

Pengubahsuaian genetik sel stem mesenchymal

Kejayaan eksperimen tambahan pengubahsuaian genetik harus diperhatikan MSC transfection Factor IX gen dalam MSCs manusia diikuti oleh pemindahan sel transfectants tikus kelemahan daya imun, yang membawa kepada penampilan dalam darah Antihemophilic Factor B lebih 8 minggu selepas pemindahan. Dalam eksperimen ini, pengubahsuaian posttranslational faktor IX dengan γ-glutamyl carboxylase dilakukan dalam sel-sel yang ditransmisikan. Transduksi daripada MSC dengan retroviral vektor pengekodan faktor manusia IX, telah kurang berjaya - pengenalan seterusnya sel-sel ini dengan anjing hemofilia di tahap terapeutik faktor IX, yang menyokong normal hemostasis intensiti pembekuan, hanya untuk 12 hari.

Pemindahan sel stem mesenchymal ke dalam parenchyma otak haiwan telah menunjukkan bahawa sel donatur yang tidak matang berubah baik dalam populasi neuron dan glia. Engraftment derivatif neuron penderma sihat tisu mesenchymal secara teori memungkinkan pembetulan keabnormalan genetik metabolisme otak pada pesakit dengan penyakit Gaucher dan gangguan lain metabolisme lipid, karbohidrat atau gangliosida.

Meneruskan eksperimen dengan syarat carian transdifferentiation sel stem dalam sumsum tulang sel-sel stromal pelopor dalam tisu saraf dan hati. Perhatian penyelidik difokuskan pada kombinasi induktor pembezaan dan media penyaman khas. Khususnya, untuk mengasingkan budaya utama dengan 10% anak lembu janin serum, sel-sel tulang sumsum stromal dibasuh dan resuspended dalam DMEM medium budaya / F12 (1/1) adalah pemain pilihan dengan kepadatan 200,000 / cm2. Selepas 24 jam, sel-sel nonadherent dikeluarkan dan dilampirkan kepada sel-sel fibroblast plastik berbudaya selama seminggu. Untuk pembezaan sel-sel stromal sumsum tulang untuk neuroblasts digunakan sederhana dingin yang diperoleh oleh pengkulturan budaya tiga hari primer tetikus fibroblas embrio, serta di kalangan DMEM / F12 (1/1) dengan 2% janin anak lembu serum dan ditambah dengan 20 ng / ml atau 10-6 M LIF asid retinoic (neyroinduktory yang digunakan untuk pembezaan neural tetikus embrio sel-sel stem dan manusia). Pembezaan sel-sel sum-sum tulang stromal ke dalam sel-sel leluhur ke dalam hepatosit telah didorong persekitaran dingin dicipta sebagai hasil daripada tiga hari pengkulturan budaya utama sel-sel hati tetikus embrio DMEM / F12 (1/1) sederhana ditambah dengan 10% janin anak lembu serum.

Di sini perlu diperhatikan lagi bahawa sel yang membentuk koloni stroma sumsum tulang adalah heteromorfik dan boleh dibahagikan kepada dua jenis. Jenis pertama termasuk sel seperti fibroblast yang membentuk sel filopodia dengan nuklei besar dan satu atau dua nukleoli. Jenis kedua diwakili oleh sel-sel kecil dari bentuk berbentuk gelendong. Dalam kedua-dua jenis kultur sel dalam jangka sederhana dingin diperolehi pada lapisan feeder utama tetikus fibroblas embrio, dan pada hari Z-4-ke-sel budaya muncul Sama neuroblasts. Pada peringkat ini mereka sering mempunyai bentuk berbentuk gelendong dengan satu atau dua proses panjang yang berakhir dengan filopodia. Sel-sel pyramidal atau stellate dengan dendrit pendek kurang biasa. Dendrit satu neuroblasts mempunyai pengembangan biasa (pertumbuhan buah pinggang) dan bercabang di bahagian distal, maka yang lain - dengan berbeza kon pertumbuhan filopodia, di mana pertumbuhan dendrite berlaku. Ciri yang sama morfologi (kon pertumbuhan buah pinggang dan filopodia a) neuroblastoma wujud, membezakan ke dalam neuron, diterangkan secara terperinci dalam kertas kerja oleh neurogenesis. Atas dasar ini, sesetengah penulis menyimpulkan bahawa sel yang mereka dapati dalam budaya adalah neuroblast. Khususnya, Schegelskaya E. Et al (2002), selepas budaya utama sel-sel stromal berbudaya selama dua minggu dalam diganti pada setiap Z-dan-4 hari sederhana dingin mendapati bahawa sebahagian daripada sel-sel membiak, mengekalkan negeri dibezakan. Secara luar, sel-sel tersebut kelihatan seperti fibroblas dan dikenal pasti dalam budaya bersama dengan membezakan neuroblast. Kebanyakan sel (kira-kira 80%) adalah pada tahap pembezaan yang berbeza ke dalam sel-sel tisu saraf, terutamanya ke dalam neuron. Proses dendritik sel-sel ini saling hubungan antara satu sama lain, sehingga secara beransur-ansur sel-sel membentuk pada bahagian-bahagian substrat dari rangkaian saraf dalam bentuk helai multiselular panjang. Proses dendritik neuroblast berkembang lebih lama, beberapa daripada mereka 8-10 kali lebih tinggi daripada panjang badan neuron itu sendiri. Secara beransur-ansur, bahagian sel piramid dan stellate meningkat. Dendrites sel stellate bercabang. Menurut pengarang, kemudian pembezaan sel-sel piramid dan seperti bintang berbanding sepadan kurus urutan peringkat biasa neurogenesis pada haiwan. Hasilnya, penulis membuat kesimpulan bahawa sel-sel stem sel stromal sumsum tulang terdedah neurogenesis teraruh di mana proses in vitro neuroblasts dijana daripada ketiga-tiga jenis utama neuron. Terdahulu sel-sel saraf juga dikesan semasa penanaman sel stroma sumsum tulang selama 3-4 hari dalam medium dengan 2% serum janin dan 20 ng / ml LIF. Tetapi dalam kes ini, sel-sel stem telah dibahagikan dengan perlahan-lahan, pembezaan neuroblasts berlaku hanya dalam 30% kes, dan mereka tidak membentuk rangkaian neuron. Menggunakan sebagai sel saraf inducers pembezaan asid retinoic, penulis diperolehi dalam budaya kepada 25-30% daripada sel-sel saraf dengan penguasaan sel glial - astrocytes dan oligodendrocytes. Neuron hanya satu pertiga daripada semua sel-sel saraf, walaupun mereka telah dibentangkan ketiga-tiga jenis: fusiform, piramid dan seperti bintang sel. Pada hari ke-6 sel stromal pengkulturan dalam asid retinoic sel-sel saraf sederhana menjadi lebih berbeza, manakala axons individu neuron piramid telah mendapati bahawa dalam neuroontogenesis biasa muncul kemudian pembentukan proses dendrit. Menurut pengarang, walaupun hasil yang rendah sel-sel saraf, kaedah mendorong asid retinoic mempunyai kelebihan: astrocytes dan oligodendrocytes dan myelinating mengendalikan fungsi-fungsi suapan semasa pertumbuhan axons dan dendrit dan adalah perlu untuk pembentukan tisu saraf normal. Oleh itu, untuk memperbaiki tapak yang rosak di vivo, lebih baik menggunakan penggantungan neuron yang diperkaya dengan sel glial.

Dalam siri kedua eksperimen, penulis cuba untuk membezakan pembezaan sel stromal sumsum tulang ke dalam sel-sel hati. Selepas budaya tiga hari sumsum tulang sel-sel stromal batang dalam medium dingin diperolehi dengan merangsang tetikus hepatosit embrio, besar, sel-sel berbentuk sfera telah dijumpai, sering dua nuklear, Kemasukan cytoplasmic dengan saiz yang berbeza. Sel-sel ini berada pada tahap yang berbeza pembezaan dan berbeza dalam saiz, bilangan nukleus dan inklusi dalam sitoplasma. Dalam kebanyakan sel-sel ini dikesan glikogen, di mana kita telah mengenal pasti mereka sebagai sel-sel hepatosit pelopor. Sejak budaya yang tidak sel dikesan Sama neuroblasts, diikuti dengan kesimpulan bahawa dalam jangka sederhana dingin yang diperoleh oleh pengkulturan hepatosit embrio, tiada faktor pembezaan sel-sel saraf dan sebaliknya, terdapat faktor-faktor yang mendorong pembezaan sel-sel stromal sum-sum tulang ke dalam sel-sel leluhur hepatosit . Penulis mencadangkan kehadiran sel pluripotent dari sum-sum tulang stroma, kerana mereka membezakan in vitro ke dalam sel-sel tisu hepatik atau neural bergantung kepada media tertentu dingin, dan pengaruh.

Dalam beberapa karya, pembezaan sel stroma sumsum tulang ke dalam sel-sel kardiomiosit, tulang rawan, tulang dan sel saraf memang ditunjukkan dengan betul. Terdapat maklumat bahawa di antara sel-sel sum-sum tulang terdapat populasi sel stem yang dapat membezakan ke dalam hepatosit. Memandangkan keputusan ini atas uji kaji pada tikus masih boleh dianggap sebagai pengesahan lain kehadiran dalam sum-sum tulang sel-sel pluripotent mesenchymal stem yang mempunyai keupayaan untuk membezakan ke dalam sel-sel pelbagai tisu organisma dewasa.

Pemindahan sel stem mesenchymal

Dalam pemindahan klinikal sel stem mesenchymal manusia boleh digunakan untuk pengembangan sel-sel stem hematopoietic dan keturunan awal mereka prekommitirovannyh. Khususnya, pengenalan sel-sel stem hematopoietic autologous dan pesakit kanser MSC selepas kemoterapi oleh tinggi mempercepatkan pemulihan dalam neutrofil dan platelet dalam darah periferal. Autologous dan pemindahan allogeneic sel stem mesenchymal digunakan untuk merawat pelbagai myeloma, anemia aplastik, thrombocytopenia spontan - penyakit yang berkaitan dengan kecacatan utama tisu stromal hematopoietic. Kecekapan terapi sel di pathologies hematologic dalam banyak kes di atas, manakala pengenalan stromal dan sel-sel stem hemopoietic, yang memperlihatkan pengurangan tempoh pemulihan selepas pembedahan, darah, penurunan dalam bilangan kematian akibat kemusnahan sel-sel kanser serantau dan beredar bukan terpilih di mana die dan sel-sel pesakit hematopoietic leluhur sendiri. MSC menjanjikan aplikasi dan lain-lain sel pelopor mesenchymal multipotent dalam amalan klinikal kerana agak mudah mereka mendapatkan aspirat sum-sum tulang, pengembangan budaya dan transfection gen terapeutik. Oleh itu untuk mengimbangi kecacatan tisu tempatan boleh menggunakan implantasi tempatan sel pelopor mesenchymal multipotent dan disfungsi sistemik tisu asal mesenchymal tidak dikecualikan pengenalan mereka ke dalam edaran umum.

Lebih berhati-hati dalam hujah-hujah mereka pengarang karya yang perspektif MSC untuk tempatan, pemindahan sistemik dan terapi gen dianalisis dari sudut pandangan sel-sel biologi stromal. Sum-sum tulang selepas kelahiran secara tradisinya dianggap sebagai organ yang terdiri daripada dua sistem utama garis sel yang dinyatakan dengan jelas - tisu hematopoietik sebenar dan stroma sokongan yang berkaitan. Oleh itu, sel-sel sum-sum tulang mesenchymal stem asalnya dianggap hanya sebagai sumber asas stromal untuk pengeluaran faktor kawal selia mikro hematopoietic. Kemudian perhatian para penyelidik beralih untuk mengkaji peranan MSC sebagai sumber batang tisu rangka. Data terkini menunjukkan potensi pembezaan sel stromal sumsum tulang dengan pembentukan tisu saraf atau otot. Dalam erti kata lain, sel-sel stem mesenchymal mempamerkan transgermalnuyu keplastikan - keupayaan untuk membezakan ke dalam jenis sel yang sel-sel tisu phenotypically tidak asli. Walau bagaimanapun, beberapa aspek biologi sel stromal sumsum tulang kekal tidak jelas dan tidak dapat diselesaikan dalam pelan biologi umum, dan secara terperinci, termasuk pengenalan, alam semula jadi, asal usul dan perkembangan dan fungsi dalam sel-sel sum-sum stromal tulang vivo dan juga perbezaan potensi yang dibenarkan ex vivo dan kemungkinan penggunaan terapeutik di vivo. Data mengenai peluang potensi MSC, dan juga hasil kajian potensi regeneratif lain sel-sel stem, berbeza dengan dogma yang ditubuhkan dalam biologi.

Apabila berbudaya di bawah keadaan ketumpatan yang rendah, sel stromal batang sumsum tulang membentuk koloni yang berbeza, masing-masing adalah terbitan satu sel prekursor. Peratusan sel progenitor stromal dalam sel-sel sumsum tulang nukleus, ditentukan oleh keupayaan untuk membentuk tanah jajahan, bergantung kepada keadaan penanaman dan spesies milik MSC. Sebagai contoh, dalam tikus untuk mendapatkan jumlah maksimum sel-sel leluhur stromal benar-benar perlu di hadapan budaya feeder sinaran sel-sel sum-sum tulang dan serum, manakala tanah jajahan membentuk kecekapan sel mesenchymal stem manusia bebas daripada feeder, atau dari medium budaya. Bilangan faktor mitogenik yang diketahui merangsang percambahan sel progenitor stromal adalah terhad. Ini termasuk PDGF, EGF, FGF, TGF-b, dan juga IGF1. Di bawah keadaan optimum, pengkulturan MSC garis polyclonal dikekalkan dalam vitro untuk lebih daripada 50 bahagian sel, yang menjadikan ia mungkin untuk menerima berbilion-bilion sel stromal sumsum tulang daripada 1 ml aspirasi ia.

Walau bagaimanapun, penduduk sel-sel stromal sumsum tulang adalah heterogen, yang menyatakan dirinya sebagai kepelbagaian dalam saiz koloni, kadar yang berbeza pembentukan mereka dan pelbagai morfologi sel yang merangkumi pelbagai spindle fibroblast seperti sel-sel rata yang besar. Dengan perkembangan tanaman sedemikian selepas 20 hari, heterogeniti fenotip juga diperhatikan. Sebahagian daripada tanah jajahan mempunyai ciri-ciri ungkapan tinggi phosphatase alkali, yang lain tidak menyatakan, dan jenis jajahan ketiga adalah fosfatazopozitivnymi di wilayah tengah dan fosfatazonegativnymi di pinggir. Koloni yang berasingan membentuk nodul tisu tulang (permulaan mineralisasi matriks ditandakan apabila berwarna alizarin merah atau kalsium oleh Van-Koss). Dalam koloni lain, pengumpulan lemak berlaku, dikenal pasti oleh G-pewarnaan dengan minyak merah. Kurang kerap koloni sel stem mesenchymal membentuk tulang rawan yang berwarna biru alcyan).

Selepas pemindahan ektopik dalam haiwan kajian polyclonal garis MGK Borang stroma tulang ektopik dengan setchatoobraznoy berkaitan dengan myelopoiesis dan adipocytes, serta, tetapi jarang sekali, dengan tisu rawan. Dalam talian monoklonal pemindahan sel stromal sumsum tulang dalam beberapa kes ada chimerism, di mana de novo tisu tulang dibentuk terdiri daripada sel-sel tulang, adipocytes terdiri daripada stroma dan penderma asal, manakala garisan sel hematopoietic dan sistem vaskular diperolehi daripada penerima.

Hasil kajian ini mengesahkan sifat stem tulang penyusun stromal, yang mana garisan klonal diperoleh. Mereka juga pada masa yang sama menunjukkan bahawa tidak semua pengklonan dalam sel-sel kultur adalah sel-sel induk multipoten. Beberapa penyelidik percaya, dan kami berkongsi pendapat mereka, bahawa maklumat yang paling tepat mengenai potensi sebenar pembezaan klon individu hanya boleh diperolehi dalam vivo selepas pemindahan, dan bukannya dengan menentukan phenotype terbitannya dalam vitro. Ungkapan dalam penanda budaya fenotip osteo- hondro- atau adipogenesis (ditentukan oleh mRNA atau melalui teknik histochemical), dan juga pengeluaran matriks galian tidak mencerminkan tahap pluripotency klon tunggal dalam vivo. Oleh itu, pengenalan sel stem dalam kumpulan sel stromal mungkin hanya posteriori, di bawah keadaan yang sesuai untuk ujian pemindahan biologi. Khususnya, chondrogenesis jarang diperhatikan dalam sistem terbuka pemindahan, manakala pembentukan rawan tidak umum dalam sistem tertutup, seperti dewan penyebaran atau dalam budaya mikromassnyh sel stromal in vitro, di mana mencapai ketegangan oksigen tempatan rendah, menyumbang kepada pembentukan rawan. Oleh itu, walaupun teknik pemindahan, serta tidak spesifik dalam keadaan budaya vitro ketara memberi kesan kepada pelbagai pembezaan MSC.

Pemindahan eksperimen dengan pemeliharaan keadaan eksperimen yang diberikan adalah standard keemasan untuk menentukan potensi pembezaan sel-sel stromal sumsum tulang dan unsur utama pengenalan mereka yang tepat. Secara sejarah, kajian pemindahan tulang sumsum tulang sumsum tulang dikaitkan dengan masalah pemindahan tulang sumsum biasa. Telah ditubuhkan bahawa persekitaran mikro hemopoietik dicipta oleh pemindahan sel-sel stromal sumsum tulang dan menyediakan perkembangan ektopik tisu hemopoietik dalam zon transplantasi. Asal usul mikro dari penderma, dan tisu hematopoietik - dari tuan rumah membolehkan kita merawat tulang ektopik sebagai pemindahan tulang sumsum "benar terbalik" yang benar. Transplantasi setempat sel stromal sumsum tulang menggalakkan pembetulan berkesan kecacatan tulang, lebih ketara daripada regenerasi reparasi spontan. Dalam beberapa kajian pra-klinikal dalam model haiwan meyakinkan membuktikan kemungkinan pemindahan sel stromal sumsum tulang di ortopedik, walaupun untuk mengoptimumkan kaedah ini, walaupun dalam kes-kes yang paling mudah, memerlukan kerja yang paling berhati-hati dan analisis. Khususnya, keadaan optimum untuk pengembangan sel stromal osteogenic ex vivo belum ditubuhkan, struktur dan komposisi pembawa yang ideal masih tidak digunakan, serta bilangan sel yang diperlukan untuk regenerasi tulang pukal.

Selain memohon ex vivo tulang sel-sel sum-sum stromal dibiakkan untuk pertumbuhan semula tisu asal mesenchymal kemuluran ortodoks MSC membuka potensi penggunaan untuk pertumbuhan semula sel-sel saraf, atau penghantaran produk gen dalam CNS. Pada dasarnya, ini memudahkan terapi selular dalam kekalahan sistem saraf, kerana tidak perlu mendapatkan sel stem neural autologous dari manusia. Ia dilaporkan mengenai kemungkinan menggunakan sel sumsum untuk penjanaan kardiomiosit dan sel-sel prekursor myogenik sebagai asal-usul stromal dan ekstrinsik yang benar.

Eksperimen sedang dijalankan ke atas pemindahan sistemik sel stromal sumsum tulang untuk rawatan penyakit kerangka umum. Tidak syak lagi bahawa sel-sel sum-sum tulang stromal adalah penduduk yang bertanggungjawab untuk gangguan genetik dalam penyakit tulang, yang juga digambarkan melalui pindahan vektor dengan menggunakan maklumat genetik sel, yang membawa kepada pembentukan tisu tulang patologi dalam haiwan kajian. Bagaimanapun, keupayaan sel stromal untuk menanam, membesar, membiak dan membezakan tulang-tulang tulang selepas pengenalan kepada aliran darah am belum terbukti.

Ini adalah sebahagiannya disebabkan oleh hakikat bahawa prosedur standard tulang sumsum stroma tidak dipindahkan dengan tisu hematopoietik, kriteria begitu ketat untuk menilai engraftment kejayaan sistemik mentadbir sel stromal masih belum dibangunkan. Perlu diingat bahawa kehadiran gen penanda dalam ekstrak tisu atau pelepasan dalam budaya sel penderma yang diperolehi tidak membuktikan engraftment sel, tetapi hanya kira-kira kelangsungan hidup mereka. Walaupun suntikan intra-arteri sel stromal sumsum tulang pada anggota badan tetikus boleh membawa kepada hampir sifar hasil engraftment, walaupun pada hakikatnya bahawa sel-sel penderma yang diperolehi didapati dalam jumlah yang besar dalam rangkaian sumsum mikrovaskular tulang. Malangnya, sel-sel tersebut biasanya digambarkan sebagai "ditimbulkan" hanya berdasarkan hasil penentuan gen penderma penanda di bawah keadaan kebudayaan ex vivo. Di samping itu, adalah perlu untuk memberikan bukti yang meyakinkan mengenai integrasi jangka panjang dalam tisu sel-sel yang berbeza dan berfungsi secara aktif dari sumber penderma. Dalam karya-karya yang diterbitkan banyak, yang melaporkan engraftment sel stromal sumsum tulang pada tulang, ia adalah menarik ialah ketiadaan data yang jelas seperti ini. Walau bagaimanapun, ia harus diperhatikan bahawa dalam beberapa eksperimen haiwan betul benar-benar menetapkan walaupun terhad, tetapi penyembuhan sebenar sel stromal leluhur selepas pentadbiran sistemik.

Data-data ini konsisten dengan hasil kajian tentang kemungkinan menyampaikan sel-sel prekursor sumsum tulang ke otot melalui sistem vaskular. Walau bagaimanapun, kita tidak harus lupa bahawa kedua-dua tisu rangka dan otot terbentuk semasa pembangunan dan pertumbuhan berasaskan sel anjakan extravascular yang menggunakan proses penghijrahan yang tidak melibatkan peredaran darah. Sekiranya terdapat saluran peredaran bebas untuk penghantaran sel-sel prekursor ke tisu fasa pepejal, adakah mungkin untuk membolehkan kewujudan sel progenitor mesenchymal yang beredar secara fisiologi? Apakah asal-usul sel-sel ini dalam kedua-dua organisma yang sedang berkembang dan postnatal, dan bagaimana mereka menembusi dinding vaskular? Penyelesaian isu-isu ini sangat diperlukan dan memerlukan analisa praplinikal yang paling teliti. Walaupun selepas jawapan kepada soalan-soalan ini didapati, aspek kinetik bermasalah yang dikaitkan dengan pertumbuhan tulang dan pembentukan semula tisu penghubung tetap tidak dapat diselesaikan. Pada masa yang sama, rawatan gangguan osteogenesis dengan menggantikan seluruh populasi sel-sel progenitor tulang yang bermutasi dengan sel-sel stromal yang sihat kelihatan sebagai perspektif klinikal yang sebenar. Dalam kes ini, ubah bentuk tempatan atau patah kerana zon osteogenesis dan tulang perubahan merosakkan patologi boleh diperbetulkan dengan menggunakan dalam vitro berbudaya sel-sel stromal stem. Oleh itu, arah penyelidikan masa depan harus difokuskan pada masalah transformasi atau pembetulan genetik sel-sel progenitor osteogenic mutated autologous ex vivo.

Kejuruteraan genetik sel, buat sementara waktu atau selama-lamanya, menjadi asas kepada sel dan biologi molekul, sumber banyak penemuan saintifik mengenai peranan protein individu dalam metabolisme sel dalam bahan-bahan vitro dan in vivo. Penggunaan teknik molekul untuk membetulkan penyakit keturunan dan penyakit manusia adalah sangat cerah untuk perubatan praktikal, kerana sifat-sifat sel-sel sum-sum stem stromal tulang dibenarkan untuk membangunkan litar unik pemindahan untuk pembetulan penyakit genetik tulang. Dalam kes ini, sel-sel leluhur mesenchymal boleh diperolehi dengan mudah dari penerima masa depan, mereka bersetuju dengan manipulasi genetik dan mampu membiak dalam jumlah yang besar dalam tempoh yang singkat. Penggunaan sel stem mesenchymal mengelakkan had dan risiko yang berkaitan dengan penghantaran bahan maklumat genetik terus kepada pesakit melalui konstruk vrtrusnye vektor. Strategi ini boleh digunakan untuk pi sel-sel stem embrionik, tetapi selepas bersalin autologous sel stromal sumsum tulang - bahan yang digemari kerana pentadbiran mereka tidak termasuk komplikasi posttransplantation imunologi. Dalam usaha untuk mencapai kesan jangka pendek, sebagai contoh untuk mempercepatkan pertumbuhan semula tulang, kaedah yang optimum adalah pengubahsuaian genetik sel mesenchymal stem menggunakan elektroporatsrsh, gabungan kimia, lipofection, plasmid dan konstruk adenoviral. Khususnya, transfection virus dalam sel-sel stromal sumsum tulang BMP-2 adalah berkesan dalam mempercepatkan pertumbuhan semula tulang di polytrauma eksperimen. Penciptaan struktur vektor adenoviral adalah lebih baik kerana ketiadaan ketoksikan. Walau bagaimanapun, pengubahsuaian genetik sel stromal sumsum tulang dalam kes ini dicirikan oleh kestabilan yang sangat rendah. Tambahan pula, normal sel-sel sum-sum tulang stromal berubah memerlukan penggunaan pembawa vektor maklumat genetik 10 kali lebih berjangkit daripada jenis sel yang lain, yang ketara meningkatkan peratusan kematian sel-sel transfected.

Untuk merawat penyakit resesif yang disebabkan oleh aktiviti yang rendah atau sifar biologi gen tertentu pengubahsuaian berpanjangan atau kekal perlu sel stem mesenchymal, yang memerlukan penggunaan adeno-berkaitan virus, retrovirus, lentiviruses dan angan-angan adeno-retroviral. Lokasi pengangkutan virus ini mampu membawa transfekte DNA besar (sehingga 8 kb). Kesusasteraan saintifik telah muncul maklumat mengenai aktiviti biologi sel-sel luaran sumsum tulang stromal transfected dengan konstruk retroviral pengekodan sintesis molekul kawal selia, dan penanda - IL-3, CD2, faktor VIII, dan enzim yang terlibat dalam sintesis L-dopa. Tetapi dalam karya-karya ini penulis menunjukkan beberapa batasan yang mesti diatasi sebelum penerapan praktikal teknologi ini bermula. Masalah pertama adalah mengoptimumkan proses pengubahsuaian MCK ex vivo. Adalah diketahui bahawa jangka panjang (3-4 minggu) dalam percambahan vitro sel-sel stromal sumsum tulang berkurangan transfected mereka. Pada masa yang sama, beberapa kitaran transfusi diperlukan untuk mencapai tahap pengubahsuaian genetik MSC yang tinggi. Masalah kedua berkaitan dengan tempoh ekspresi gen terapeutik, yang belum melebihi empat bulan. Pengurangan semulajadi dalam ekspresi gen berkesan adalah disebabkan oleh ketidakaktifan para promotor dan kematian sel yang diubah suai. Dalam pemindahan prospek umum maklumat genetik dengan menggunakan sel-sel stem mesenchymal hasil kajian awal menunjukkan keperluan untuk pengoptimuman lanjut kaedah transfection ex vivo, memilih penganjur yang mencukupi mengawal selia aktiviti biologi ke arah yang betul, dan meningkatkan keupayaan sel-sel sum-sum stromal tulang diubahsuai untuk diri memperbaharui in vivo selepas pemindahan. Harus diingat bahawa penggunaan rekaan retroviral untuk mengubah suai sel-sel stromal sumsum tulang ke arah yang betul tidak selalu memerlukan pengalihan mandatori mereka. Transfected sel stem mesenchymal boleh melakukan fungsi pembetulan pada latar belakang yang stabil dan kediaman tanpa memerlukan penubuhan fizikal aktif dan berfungsi dalam tisu penghubung. Dalam kes ini, ia harus dianggap sebagai biologi mini pam, menghasilkan dalam faktor vivo, kekurangan yang menentukan manifestasi penyakit genetik.

Penggunaan sel-sel sum-sum stromal tulang berubah untuk rawatan penyakit genetik dominan yang mempunyai ciri-ciri ekspresi gen atau tidak normal aktiviti biologi patologi, adalah lebih bermasalah kerana dalam kes ini adalah perlu untuk menyekat pemindahan atau penjualan maklumat genetik diputarbelitkan. Salah satu kaedah kejuruteraan genetik - penggabungan semula homolog sel-sel stem embrio untuk menjana haiwan transgenik. Walau bagaimanapun, tahap yang sangat rendah rekombinan homolog, digabungkan dengan masalah pengenalan, pemisahan dan pengembangan rekombinan itu tidak mungkin untuk menggalakkan penggunaan meluas teknik ini dalam masa terdekat, walaupun pembangunan kaedah teknologi baru. Pendekatan kedua untuk terapi gen adalah berdasarkan patologi pembetulan automatik dominan DNA rosak mutasi genetik boleh diperbetulkan dengan pengenalan DNA luaran dengan urutan yang dikehendaki (oligonukleotida DNA pendek, atau kimera oligonukleotida RNA / DNA) yang mengikat homologs dalam genom yang rosak. Penjelmaan ketiga menyediakan patologi kunci penghantaran maklumat yang dicapai melalui penggunaan oligonukleotida direka khusus yang mengikat kepada gen tertentu untuk membentuk struktur heliks pertigaan, yang tidak termasuk kemungkinan transkripsi.

Walaupun pembetulan penyakit genetik pada tahap genom adalah optimum dan kaedah terapeutik pilihan, mRNA juga vektor menjanjikan (mungkin juga lebih mudah) untuk menyekat gen negatif dominan. Dalam usaha untuk menghalang terjemahan dan / atau meningkatkan degradasi mRNA telah lama digunakan dengan molekul protein antisense urutan oligonucleotide atau menyekat penuh mengikat mRNA radas biosintetik sel. Juga, RNA dua terkandas mendorong degradasi mRNA pesat, mekanisme yang masih tidak dijelaskan sepenuhnya. Walau bagaimanapun, ia adalah tidak mungkin bahawa penyingkiran semata-mata mRNA disalin daripada alel mutan dengan mutasi pendek atau tunggal akan menggalakkan ungkapan mRNA allele biasa. Alternatif ialah penggunaan ribozinov hammerhead dan tajam, mempunyai keupayaan untuk mengikat ke laman web yang sangat khusus mRNA dengan induksi seterusnya belahan dan inactivation mereka semasa penterjemahan. Pada masa ini, kemungkinan menggunakan kaedah ini dalam rawatan osteogenesis patologi sedang dikaji. Tidak kira apa sebenarnya sasaran - elemen genomik atau cytoplasmic kejayaan teknologi terapi gen baru akan ditentukan oleh kecekapan kemasukan reagen dalam sel-sel sum-sum stromal tulang ex vivo, pilihan optimum vektor tertentu dan keupayaan stabil sel mesenchymal stem menyatakan faktor dikehendaki dalam vivo.

Oleh itu, penemuan sel stem mesenchymal dengan sifat mereka yang tidak dijangka mewujudkan skim konseptual baru untuk pembangunan sel-sel. Tetapi untuk memahami peranan biologi sel stromal stem, alam semula jadi mereka, keupayaan untuk transdifferentiation atau dedifferentiation, kepentingan fisiologi mereka dalam proses perkembangan embrio, pertumbuhan selepas bersalin, kematangan dan penuaan, dan juga dalam penyakit manusia memerlukan penyelidikan lanjut antara disiplin.