Sel stem embrionik

Penemuan sel-sel stem embrionik - tidak ada kemalangan, dan muncul di penyelidikan tanah yang disediakan dalam bidang penyelidikan biologi perkembangan. Istilah "sel stem" telah diperkenalkan ke dalam perubatan pada tahun 1908 di Persatuan Kongres Hematology di Berlin, Alexander Maximov digunakan pada sel hematopoietic. Lama sebelum pengasingan dan penyediaan garis stabil sel-sel stem embrionik pluripotent dalam pembangunan awal proses penyelidikan yang digunakan terato- stem (sel embrio-carcinoma dengan yang mengkaji mekanisme yang tidak diketahui embriogenesis, termasuk urutan ungkapan gen awal dan produk protein kerja mereka.

Tetapi adalah totipotensi genom manusia yang tidak dapat ditarik balik dalam proses evolusi? Tidak, dan embriogenesis adalah bukti. Jika demikian, maka, pada dasarnya, apakah jalan kedua pembangunan evolusi dapat direalisasikan? Mungkin, apabila seseorang meninggalkan Cosmos, di mana keadaan alam sekitar akan tetap agak lama. Kehilangan tulang (demineralisasi tulang dalam keadaan nirberat) pembentukan semula dengan perlahan-lahan yg setuju dan pertumbuhan semula boleh dianggap sebagai langkah pertama untuk proses penyesuaian manusia sebagai spesies yang wujud di ruang. Walau bagaimanapun, pembayaran untuk laluan kedua pembangunan evolusi akan berbeza - kemandulan akan menjadi harga untuk membayar balik kepada semua sel-sel yang sama dengan totipotency dan kepekaan mutlak. Jadi, kalikan dalam dunia ini "chameleons evolusi" tidak akan mempunyai meiosis, otpochkovaniem. Tetapi kita akan hidup lama. Keabadian Telomerase adalah keabadian ameba. Dalam organisma multiselular, sel stem adalah substrat panjang umur kuantitatif dan kualitatif.

[1], [2], [3], [4]

Sumber sel stem embrio

Sumber hari ini sel-sel stem embrio untuk ujian makmal adalah Line murine teratocarcinoma (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) dan teratocarcinoma manusia (NTERA-2, TERA-2 , H-9 klon), serta Hess Trauneona. Walau bagaimanapun, kehadiran terperinci pasport selular menunjukkan phenotype imun, keputusan analisis kromosom profil ungkapan mRNA terdedah reseptor dan protein isyarat intrasel tidak mengimbangi kelemahan yang ketara teratokartsinomnyh garis ESC - kerugian pesat totipotency dan kemustahilan permohonan dalam ujian klinikal, dan pembezaan campuran dalam budaya adalah amat sukar untuk mengasingkan garis khusus yang tulen dari populasi sel yang berkerumun. Oleh itu, biasanya sumber garis ESC dihasilkan untuk tujuan klinikal, berkhidmat sebagai jisim sel dalaman blastosista, embrio blastomer individu peringkat 8-sel pembangunan, sel-sel morula peringkat akhir, dan sel kuman utama.

Perlu diperhatikan bahawa sel teratokarsinoma, walaupun mereka memiliki sifat pluripotensi, mempunyai potensi pluripotent yang jauh lebih rendah berbanding ESC. Integrasi mereka dengan sel embrionik jarang membawa kepada pembentukan chimeras, di mana, selain itu, gamet dengan genotip sel teratokarsinoma tidak pernah terbentuk. Adalah dipercayai bahawa ini adalah disebabkan oleh kelainan kerentanan kromosom dalam penanaman sel teratokarcin: kehilangan kromosom Y, pelbagai trisomi, penghapusan, atau translocation.

Percubaan untuk membezakan garis ESC manusia telah dilakukan berkali-kali, tetapi tugas ini tidak dapat diselesaikan, kerana manusia biasa blastocysts sukar untuk mengakses objek. Di samping itu, pada manusia, kekerapan kelainan kromosom adalah lebih tinggi daripada embriogenesis haiwan. Majoriti embrio manusia yang terdahulunya diperolehi setelah persenyawaan in vitro menunjukkan mosaicisme kromosom yang kacau dan sering terdapat penyimpangan berangka dan struktur. Walau bagaimanapun, pada peringkat blastokis, hanya 20-25% embrio manusia terdiri daripada sel-sel dengan karyotip biasa. Ia hampir mustahil untuk menggunakan embrio tersebut untuk mencipta ESC, kerana zygote biasanya berbudaya ke peringkat dua atau empat blastomer dan kemudian ditransplantasikan ke dalam rahim. Baru-baru ini adalah teknik yang boleh dipercayai untuk penanaman ovula manusia yang telah disenyawakan ke peringkat blastokis. Pengenalan teknik ini ke dalam amalan persenyawaan in vitro bukan sahaja meningkatkan kekerapan hasil implantasi yang berjaya, tetapi juga menjadikan blastokista biasa objek yang lebih mudah diakses.

Satu lagi sumber sel stem pluripotent adalah sel-sel seks utama, yang, berbeza dengan penduduk leluhur lebih maju germenativnogo epitelium, tidak di permukaan beta-integrin, tetapi menyatakan aktiviti yang tinggi shelochnoy phosphatase. Harus diingat bahawa dalam eksperimen ini, populasi sel induk, yang terbentuk dari sel-sel seks primer, telah dipelajari sejak tahun 80an abad yang lalu. Pada masa yang sama, satu teknik untuk mengasingkan sel-sel kuman utama dari rudiment gonad embrio tikus telah dibangunkan. Hasil pertama yang tidak berjaya dalam penanaman sel-sel kuman utama dalam vitro mencadangkan keputusasaan ini, kerana sel-sel, walaupun mereka selamat, tidak berkembang dan mati dalam 24 jam pertama. Kemudian didapati bahawa sel-sel kuman utama tikus membiak dalam vitro hanya dengan kehadiran faktor-faktor pertumbuhan polipeptida tertentu yang terlarut dan membran membran dalam media kultur. Hasil kajian menunjukkan bahawa kelangsungan hidup dan perkembangan sel-sel kuman utama memerlukan kehadiran dalam medium budaya bukan sahaja LIF, tetapi juga membran membran, serta faktor kelarutan larut (SIF). Peptida yang dihasilkan oleh embrio sel somatik homozygous untuk mutasi daripada keluli, dan salah seorang daripada mereka ialah ligan daripada cKit proto-onkogen yang.

Sel germinal utama mamalia dan manusia berasal dari extragadad dan merupakan sumber perkembangan klon sel sel seks. Permulaan garis sel kuman utama, serta semua tisu embrio, serta mesoderm ekstremik, memberikan epektik (ektoderm primer) daripada embrio awal, yang mempunyai organisasi struktur mosaik. Penyingkiran microsurgical dari pelbagai bahagian embrio awal menubuhkan zon penyetempatan di epiblast klon prekursor komplit sel germinal utama. Dengan bantuan rhodamine dextran, yang digunakan sebagai penanda sel, ia telah ditetapkan bahawa prekursor sel-sel seks utama terletak di rantau epiblast proksimal, di samping ectoderm ekstremonik tambahan. Sel sel seksual utama muncul dari klon sel 45, peruntukan yang berlaku pada awal gastrula. Kemudian pengasingan klon berlaku, dan semasa gastrulasi, sel-sel seks utama memasuki mesoderm ekstremik dan dijumpai di pangkal putaran allantois, di belakang kumpulan utama. Dari sana sel-sel kuman utama berhijrah ke ujung ventral endodervik endoderm dan kemudian bergerak secara aktif di sepanjang mesentery, memancarkan penggelek kelamin pada akhir penghijrahan. Dalam proses penghijrahan, serta dalam 2-3 hari pertama lokalisasi dalam rudiment gonad, sel-sel seks utama aktif berkembang dan menjalani lapan siklus replik. Sekiranya pada permulaan penghijrahan terdapat kira-kira 50 sel kuman utama, dalam kromosom pembiakan embrio dalam perkembangan 12 hari, jumlah sel seks utama melebihi 25,000.

Persamaan fungsi ESCS dan sel-sel kuman purba menunjukkan integrasi penuh yang kedua dalam penggantian blastocyst jisim sel dalaman dan pembangunan penuh berikutnya embrio, tisu yang hanya terdiri daripada keturunan sel-sel kuman purba. Mengikut ciri-ciri lain murine sel germa utama PGC juga sama, menunjukkan keupayaan untuk membezakan ke dalam arah yang berbeza, untuk membentuk badan embrio in vitro, dalam vivo bentuk teratomas apabila disuntik subcutaneously ke dalam tikus immunodeficient menyerupai teratomas spontan tikus testis talian 129 / ter.

Ia ditubuhkan bahawa, apabila ditambah kepada LIF sederhana, dan membrannosvyazannogo larut SIF diasingkan sel germa utama 8 hari embrio murine terus hidup dan berkembang dalam budaya selama 4 hari tetapi kemudian mati. Selain itu, tempoh apabila budaya kematian diperhatikan sel-sel kuman asal bertepatan dengan peringkat perkembangan embrio tikus (12,5-13,5 hari), apabila gonad sel-sel kuman perempuan tunas utama masukkan meiosis, dan dalam sel-sel kuman asal lelaki disekat mitosis bahagian. Walau bagaimanapun, jika anda menambah kepada alam sekitar bukan sahaja pertumbuhan faktor LIF dan SIF, tetapi juga FGF2, sel-sel kuman utama terus proliferirovat, dan subbudaya terbentuk jajahan sel boleh membiak walaupun selepas dikeluarkan dari persekitaran faktor pertumbuhan (SIF dan FGF). Sel-sel seperti ini boleh dibiakkan untuk jangka masa panjang pada substrat fibroblast embrio tanpa penambahan faktor pertumbuhan larut LIF. Ia adalah sel-sel sel yang stabil yang diperoleh daripada sel-sel germinal utama yang dicadangkan untuk dipanggil sel-sel kuman embrio. Istilah ini tidak boleh dianggap berjaya apabila berbudaya EG-sel tidak boleh diperolehi sel germa embrio, mampu menjalankan peringkat seterusnya oogenesis atau spermatogenesis. Ini adalah disebabkan oleh hakikat bahawa garis-garis EG-sel, walaupun berasal dari sel germ primordial, tetapi dalam budaya memperoleh sifat-sifat sel-sel stem pluripotent embrio kehilangan keupayaan mereka untuk melakukan talian germenativnye itu. Dalam erti kata lain, sel-sel seks utama kehilangan sifat prekursor gamete apabila ditanam dan diubah menjadi sel-sel pluripoten seperti ESC.

Telah diperhatikan bahawa apabila tikus EG immunodeficient diberikan, teratoma tidak timbul. Adalah diandaikan bahawa kehilangan keupayaan sel EG manusia untuk memulakan teratomas disebabkan oleh fakta bahawa garis-garis ini tidak dicipta secara langsung dari sel-sel kuman primer yang berbudaya tetapi diperoleh dari sel-sel yang terisolasi dari badan-badan embrioid. Oleh itu, adalah mungkin mereka adalah keturunan pluripotent, tetapi sudah melakukan komplikasi.

Perlu diperhatikan bahawa terdapat perbezaan asas antara sel EG dan sel-sel germinal utama. Yang terakhir tidak memungkinkan untuk mendapatkan embrio tikus chimeric, yang menunjukkan kekurangan kemampuan sel-sel kuman primer untuk mengintegrasikan ke dalam jisim sel dalaman atau trophectoderm. Ciri-ciri populasi sel-sel seks primer lebih mirip dengan sel komplikasi sel somatik embrio kemudian, pengenalan yang ke dalam blastocyst juga tidak menyebabkan pembentukan embrio chimeric.

Teknik pengubahsuaian pengkulturan badan-badan embrio diperolehi dengan EG-pengagregatan sel dibenarkan dengan pemilihan pada media terpilih untuk menerima satu lagi penduduk sel pluripotent, yang dipanggil "sel-sel yang diperolehi daripada badan-badan embrio (badan embrio sel-sel yang diperolehi - EBD-sel). Keupayaan sel EBD untuk membiak dalam masa yang lama dalam budaya yang dibenarkan untuk mewujudkan sel-sel sel komitmen sel yang stabil. Clon sel yang mengekspresikan spektrum luas mRNA dan penanda protein sel khusus telah diperolehi. Pendekatan ini hasilnya membuktikan bahawa seks utama sel-sel pluripotent manusia, dan membezakan in vitro ke dalam pelbagai jenis sel: neuron, glia, endothelium vaskular, sel-sel hematopoietik, otot, dan sel-sel endodermal.

Sumber alternatif sel stem embrionik

Sumber alternatif jalur ESC manusia boleh menjadi sel hibrid. Implantasi ke dalam rahim struktur lembu pseudopregnant geterogenomnoy diperolehi apabila bergabung melalui electroporation fetusa sel soma manusia dengan lembu telur, yang sebelum ini telah dikeluarkan daripada pronucleus, membuat ia mungkin untuk menerima jisim sel dalaman pra-implantasi embrio peringkat perkembangan tiruan. Untuk ini, blastocyst dari telur lembu dengan nukleus sel yang dipindahkan dari sel manusia diperoleh pada peringkat pertama.

Di peringkat kedua, embrioblast diekstraksi dari blastokista, dan daripadanya - ESC mengikut kaedah Thomson. Perlu diperhatikan bahawa hasil yang terbaik untuk pengasingan garis ESC menggunakan kaedah ini diperolehi menggunakan nuklei sel folikular atau sel-sel kuman primer yang berterusan di dalam tubuh manusia dalam keadaan hibernasi. Ini adalah disebabkan oleh hakikat bahawa telur lembu dipindahkan sel-sel manusia neukorochennye nukleus perlu mempunyai aktiviti yang tinggi dan telomere telomeazy yang mengelakkan penuaan awal klon ESC berasal dari telur hibrid (Repin, 2001). Telah diketahui bahawa penanda intrapelular yang paling penting protein EGF adalah Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, yang tergolong dalam protein silencer kromatin yang disebut. Penyenyap menyediakan pembungkusan heterochromatin yang padat, yang menghalang pembentukan gelung euchromatin. Pakej kromatin yang ditengah oleh protein ini berkorelasi dengan totipotency genom ESC. Hari ini mendapati bahawa telur yang matang dalam lembu dan manusia adalah satu-satunya spesis sel-sel khusus yang mengandungi kepekatan tinggi penyenyap protein dalam sitoplasma. Atas dasar ini, satu kaedah telah dibangunkan untuk penghasilan ESC hibrid dengan memindahkan nukleus sel somatik ke ovula bukan nuklear lembu. Kajian in vitro awal telah menunjukkan bahawa sitoplasma sel telur lembu memulihkan totipotensi genom nukleus sel somatik manusia dalam penanaman 12-24 jam.

Kepentingan tertentu adalah data mengenai ciri-ciri pembangunan preimplantation embrio manusia, yang menunjukkan penggantian sel totipoten oleh populasi sel pluripoten daripada tikus. Kajian transformasi sel menunjukkan sel-sel jisim sel dalaman manusia blastokyst, selain ESCs, juga menjana sel trophoblast, yang menunjukkan jumlah potensi mereka.

Telah diketahui bahawa pada tahap blastocyst terdapat dua populasi sel yang berlainan. Salah satunya adalah lapisan luar blastokist, trophektoderm, yang berasal dari sel trophoblast dan komponen plasenta embrio lain. Populasi kedua sel dikelompokkan menjadi jisim padat, yang menghubungkan permukaan batin tropectoderm. Populasi sel jisim sel dalam berasal dari semua tisu dan kuman organ-organ embrio. Pada peringkat akhir blastocyst, endoderm tambahan-embrio dibentuk dari jisim sel dalaman dan epiblast terbentuk (ectoderm utama). Pada masa yang sama, sel epiblast mengekalkan pluripotency, manakala keupayaan untuk membezakan sel-sel endoderm tambahan-germinal adalah terhad.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Mendapatkan sel induk embrionik manusia

Sehingga baru-baru ia dipercayai bahawa trophoblast diperolehi daripada hESCs mustahil. Walau bagaimanapun diploid sel-sel stem talian trophectoderm diasingkan daripada blastocyst dalam medium yang mengandungi, bukan LIF dan FGF2 heparin, proliferates dan berubah menjadi sel-sel stem. Jika anda mengalih keluar dari tengah-tengah FGF2, sel-sel trophectoderm menghentikan pembiakan, mereka mula endoreduplication kromosom dan unsur-unsur sel trofektodermalnye secara beransur-ansur berubah menjadi sel-sel trophoblast gergasi. Mungkin, LIF tidak merangsang pembiakan sel-sel trophectoderm disebabkan oleh hakikat bahawa FGF2 mencetuskan transsignalizatsii mekanisme sebagai FGF2, mengikat kepada reseptor cytoplasmic (FGFR2), aktifkan kinase MAP dalam sitoplasma - ERK1 dan ERK2. Oleh itu, apabila dimasukkan ke dalam sel-sel blastocyst satu isyarat laluan (LIF - gpl30 - JAK-kinase - STAT3) sel-sel jisim sel dalaman diubah menjadi hESCs pluripotent, manakala mengaktifkan mekanisme kedua transmembran isyarat (FGF2 - FGFR2 - MAP kinases ERK1 / ERK2) sel stem dalam trophectoderm blastocyst yang terbentuk. Pemilihan laluan isyarat, seterusnya, bergantung kepada aktiviti oct4 gen. Ini gen milik domain POU, yang terletak di lokus t 17 autosom dan dinyatakan semasa oogenesis, dalam tempoh menghancurkan serta dalam sel-sel jisim sel dalaman blastocyst, dan dalam sel-sel kuman purba. Fungsi gen peranan oct4 adalah pengekodan faktor transkripsi perlu untuk berlakunya sel pluripotent, pembezaan dan dedifferentiation mereka.

Ungkapan gen oct4 dalam ESC berbeza-beza bergantung pada interaksi faktor transkripsi ini dengan cofactors. Peraturan penunjuk oct4 dalam blastocysts menunjukkan bahawa apabila aktivitinya menurun, separuh daripada sel membentuk tropectoderm, sedangkan dengan peningkatan ekspresi teraruh dari oct4, kebanyakannya ESC berlaku.

Dalam eksperimen, ESC tidak boleh menterjemah dalam garis dengan pengkulturan blastomer totipotent peringkat belahan dan pada grastulasi peringkat dan peringkat akhir perkembangan embrio. Mouse ESCS biasanya memperuntukkan sekurang-3.5-4.5 hari kehamilan, yang sepadan dengan keenam (lapisan tunggal blastosista) dan peringkat ketujuh (dua lapisan blastocyst - satu telur silinder awal) embriogenesis normal. Jelas, hanya dalam tempoh preimplantation, embrio tikus mengandungi populasi selular yang boleh diubah menjadi ESC. Akibatnya, pengasingan garis ESC hanya boleh dilakukan pada peringkat embriogenesis tertentu. Totipotent, dari segi peluang untuk pembangunan embrio yang berdaya maju daripada membran embrio dan plasenta adalah zigot dan timbul semasa blastomer menghancurkan. Kehilangan jumlah potensi sel-sel germinal bermula pada peringkat morula yang lewat, apabila kombinusi blastomere lebih lanjut bergantung pada lokasi mereka. Blastomer morula awal mengekalkan totipotency sebagai manipulasi eksperimen dengan menukar lokasi mereka, seperti penyongsangan lokasi mereka, tidak menghalang pembangunan gred tinggi embrio.

Telah didapati bahawa kecekapan pembebasan ESC dalam talian dipengaruhi oleh keadaan blastocysts pada masa penerokaan mereka. Penggunaan blastocysts selepas simulasi tujuh hari diapause dalam saluran kemaluan tikus, ovariectomized pada 3.5 hari kehamilan dan dirawat dengan progesteron, menyumbang kepada pemisahan yang lebih berjaya baris sel-sel stem embrio. Diasumsikan bahawa di bawah keadaan sedemikian bilangan blastomer membentuk peningkatan jisim selular dalaman. Ia juga mungkin kitaran sel meluas dan kebanyakan blastomer memasuki fasa G0.

Selain itu, penciptaan baris hESC pluripotent stabil bergantung kepada embrio genotip: cukup mudah dibezakan daripada ESCS Murine blastocysts talian 129, adalah jauh lebih sukar untuk mendapatkan mereka dengan menggunakan tikus CS7BL / 6 dan hampir mustahil untuk mengasingkan garisan dari hESCs blastocysts CBA / Ca tikus. Jelas, embrio awal mempunyai beberapa ciri genetik yang mempengaruhi perkembangan garis ESC pluripoten. Walau bagaimanapun, apabila epiblast berbudaya terlindung, dan juga dengan pemilihan terpilih membezakan garis sel hESCs daripada embrio awal CBA / Ca tikus masih diperuntukkan.

Teknik standard yang terbukti untuk mendapatkan garis ESK dari blastocysts diberikan dalam manual makmal mengenai teknik percubaan dengan embrio awal. Eksperimen Hess boleh diperolehi dengan pengkulturan yang epiblast terpencil (ektoderma utama) embrio tetikus 4.5-hari-tua menggunakan teknik microsurgical syarat penanaman yang agak kompleks dan diubah suai. Kerumitan prosedur ini adalah wajar, kerana kekerapan pembentukan garis ESC jauh lebih tinggi daripada kerja dengan jisim sel dalaman blastocyst.

Untuk mengasingkan garisan ESC, setiap klon dipindahkan ke mikro-sum, agregat 40-60 sel ditanam, ia disebar lagi. Pelbagai ulangan prosedur ini membolehkan untuk mendapatkan diabadikan talian ESK dengan sel-sel normokariotipnyh Kadar percambahan maksimum melekat plastik, yang melalui saluran 50-100 mengekalkan totipotency dan aktiviti telomerase tinggi. Dalam proses sokongan baris ESC bahaya yang paling besar adalah pencemaran atau serum endotoksin bakteria - walaupun kesan kepekatan endotoksin dalam medium budaya menyebabkan kematian jisim sel-sel kuman tidak matang. Dengan kawalan yang teliti pertumbuhan linear dan penyebaran yang tepat pada masanya ESCS dalam budaya mampu pembelahan simetri, di mana kedua-dua sel anak kekal pluripotent dan dapat melaksanakan nombor yang tidak terhad kitaran sel, mengekalkan kariotip diploid dan jumlah potensi.

Pemilihan penduduk tulen ESCS manusia boleh dijalankan transfection berikut ke dalam genom mereka molekul DNA rekombinan yang mengandungi gen pengekodan sintesis protein pendarfluor hijau (GFP). Ungkapan GFP meningkat dengan berkembang ESCS dalam persekitaran menyokong perkembangan mereka, manakala awal pembezaan tahap gen dikurangkan, yang membolehkan dipilih pada medium stabil, bahagian sel tulen pluripotent terpilih. Apabila pengkulturan diasingkan melalui kekerapan GFP-pilihan PGC pembentukan koloni bertambah banyak kali, seperti dalam syarat-syarat pembiakan tanaman disingkirkan kesan antiproliferative kuat sel-sel dibezakan.

Terjemahan dari sel-sel stem embrionik manusia selaras dengan cara kaedah mereka pengasingan embrio preimplantation (langkah 80-120 sel), yang kekal selepas in vitro prosedur persenyawaan. Untuk melakukan ini secara sintetik dihasilkan "lebihan" embrio mekanikal tersebar dalam jarum sederhana Delbekko. Selepas melabelkan sel dengan antibodi monoklonal label pendarfluor terpilih embryoblast sel terpencil. Embryoblast tersebar ke sel-sel tunggal dengan campuran collagenase-dispase. Sel pun berlepas telah ditanam dalam medium khas (80% Delbekko sederhana + 20% anak lembu janin serum di hadapan 500 .mu.g / ml IL-6, LIF dan SCF) pada monolayer fibroblas embrio feeder 3 petikan pertama. Oleh itu terus hidup dan pembiakan sel-sel stem dan leluhur dikekalkan oleh pendedahan kepada IL-6, LIF dan SCF. Dalam persekitaran ini, hESCs penggantungan berkembang klon osharennyh sel terikat kepada dijauhkan oleh pipetting berbilang lembut. Klon baru muncul dalam budaya yang digantung pada hari ke-5. Kadar pertumbuhan maksimum ESC dicapai oleh pemisahan berulang klon pada tahap 10-15 sel. Kemudian, setiap klon dipindahkan ke microcell dan berkembang menjadi agregat 40-50 sel. Prosedur ini diulang banyak kali dalam petikan, meningkatkan jumlah budaya kepada kepadatan 5-10 juta sel per 6 cm hidangan. Dengan menggunakan apa-apa Thomson passaging ia telah diasingkan 10 klon ESCS manusia abadi yang melalui saluran 100 mengekalkan aktiviti telomerase tinggi, keupayaan untuk percambahan sengit dan ciri-ciri fenotip minimum jumlah potensi, dengan perbezaan dalam mana-mana 350 bahagian sel khusus yang diperolehi ecto-, meso- - dan endoderm. Pembezaan ESC manusia bermula (pada perubahan sederhana, penambahan dan penghapusan LIF serum) dengan lampiran sel kepada substrat, menunjukkan pembangunan Sitoskeleton dan ungkapan reseptor melekat. Ia adalah penting bahawa percambahan terbatas ESCS manusia dikekalkan kariotip biasa.

Kaedah kedua mengasingkan garis ESC manusia adalah berdasarkan penggunaan sel seks utama. Kajian eksperimen telah menunjukkan bahawa garis-sel Eu boleh diperolehi daripada plak genital embrio tikus 12,5 hari yang lama. Walau bagaimanapun, dalam kes ini, kekerapan pembentukan sel-sel sel progenitor adalah jauh lebih rendah daripada dalam eksperimen dengan embrio terdahulu. Pada masa yang sama, sel-sel seks utama dari gonad embrio tikus pada usia kehamilan 13.5 pada umumnya tidak mampu berubah menjadi garis.

Sel-sel EG manusia pluripoten yang stabil pertama diperoleh daripada gonosit primer yang terisolasi dari tunas genital embrio berusia 5-9 minggu. Sel terpencil telah diternak pada substrat tikus yang dilemahkan fibroblas embrio DMEM sederhana dengan serum janin, yang telah ditambah merkaptoetanol, forskolin, serta faktor-faktor pertumbuhan manusia rekombinan (FGF dan LIF). Selepas 7-12 hari, koloni multiselular muncul dalam budaya, menurut ciri morfologi dan penanda molekul yang bersamaan dengan sel EG manusia. Selepas pengagregatan, sel-sel ini membentuk badan-badan embrioid, dengan perkembangan selanjutnya yang mana sel-sel khusus muncul, ciri-ciri derivatif ketiga daun embrio ini. Sepanjang 10-20 saluran sel sel EG mengekalkan karyotype biasa dan tidak kehilangan pluripotency.

Ia juga menunjukkan bahawa gabungan gabungan LIF, faktor-faktor keluli membran dan terlarut, serta TGF-b, mengubah program untuk pembangunan sel-sel germinal utama. Daripada menghentikan bahagian mitosis dan mula membezakan ke arah oogenesis atau spermatogenesis, sel-sel seks utama terus berkembang. Selepas beberapa kitaran mitosis tambahan mereka menjadi sama dengan sel epiblast dan, kehilangan sifat-sifat prekursor sel-sel kuman, berubah menjadi sel EG batang pluripotent embrionik.

Oleh itu, pada tahun 1998, sel-sel seksual utama yang dihidupkan pertama kali diasingkan dari rutin seksual pada janin otot janin. The embriogenesis sel-sel kuman utama manusia muncul dalam kantung kuning telur pada minggu ketiga pembangunan, dan pada minggu 4-5, sel-sel ini berhijrah ke kawasan bonggol seksual, di mana mereka membentuk penduduk gonocytes dormantnye utama. Di dalam keadaan yang tidak aktif, sel-sel germanium utama kekal di putik sehingga kelahiran. Bahagian sel kuman utama dipetik daripada bonggol kemaluan embrio 5-9 minggu berusia janin diambil bekas kain tempore yang dirawat dengan campuran jenis collagenase IV-V, hyaluronidase dan DNase untuk hasil peningkatan sel kuantitatif dan kualitatif. Sel-sel germinal utama dalam tisu tubercle janin janin dikelilingi oleh sel stromal Sertoli (mesenchymal). Tujuan fungsi sel-sel Sertoli adalah pengeluaran faktor anti-apoptotic (Fas-ligan), mitogens, dan ejen imunosupresif yang melindungi sel-sel stem seksual daripada serangan imun oleh tubuh. Di samping itu, persekitaran mikro stromal tubercle memainkan peranan penting dalam pematangan gamet. Sel-sel kuman utama terpencil dalam budaya yang ditanam di atas lapisan feeder stromal yang terdiri daripada fibroblas dari janin tiga petikan pertama. Kombinasi mitogens yang paling berkesan adalah kompleks yang terdiri daripada LIF, FGF dan forskolin (perangsang untuk pembentukan cAMP). Percambahan sel-sel kuman primordial in vitro memerlukan penambahan serum janin, di hadapan yang gonocytes pembiakan utama di klon budaya diiringi oleh pembentukan globular, sel-sel bukan pengikut kepada substrat.

The US National Institutes of Health atas dasar merumuskan maklumat yang sedia ada pada kaedah peruntukan garis ESC manusia dari blastocysts telah membuat kesimpulan awal bahawa peruntukan kejayaan ESC adalah yang paling mungkin apabila blastocysts berbudaya dengan jisim sel dalaman dibentuk dengan baik (Sel stem: kemajuan sains dan arah penyelidikan masa depan Nat. Inst, Kesihatan Amerika Syarikat). Dari sudut pandangan ini, sumber terbaik ESCS untuk mewujudkan garisan blastocyst manusia hari 5th pembangunan, di mana peruntukan jisim sel dalaman perlu berhati-hati mengeluarkan trophectoderm. Terpencil jisim sel dalaman yang terdiri pada peringkat ini 30-35 sel mesti ditanam pada substrat fibroblas embrio murine, yang merupakan syarat penting untuk pembentukan koloni dalam budaya hESCs.

Analisis ciri fenotip sel-sel stem embrionik

Faedah interspecies pasti analisis perbandingan ciri-ciri fenotip daripada ESC. Ia telah mendapati bahawa manusia jajahan ESC - satu kelompok padat diratakan epitelium-sel, manakala tikus anak lembu embrio terdiri daripada konglomerat longgar sel-sel bulat. Dalam indeks ESC manusia nisbah plasmatik nuklear adalah lebih rendah daripada di ESCS tetikus. Monyet sel-sel stem embrionik membentuk koloni rata sel-sel lebih bergerigi. Dalam klon awal primata ESC, sel tunggal mudah dilihat. Membiak hESCs semua spesies haiwan tidak menyatakan MHC kelas I dan II. Pada masa yang sama, ESCS manusia memberi respons positif terhadap antibodi TERA 1-60 dan GCTM-2, yang menunjukkan kehadiran di permukaan keratin / kondroitin sulfat proteoglikan, ciri embrio (teratomas) sel-sel stem -kartsinomnyh mereka. Ungkapan dalam hESCs semua jenis gen haiwan oct4 menunjukkan bahawa, walaupun terdapat perbezaan fenotip dalam ESCS manusia dan tetikus, nampaknya diaktifkan dengan set yang sama gen bertanggungjawab untuk mengekalkan pluripotency (Peru, 2001) itu. Di samping itu, garis ESC diperolehi daripada tikus embrio, babi, arnab, primat, dan lembu, mempunyai ciri-ciri morfologi sama, set yang sama pengenalan molekul penanda dan mekanisme molekul yang hampir sama bagi pelaksanaan program embriogenesis yang membolehkan anda untuk melihat seperti isu Xenotransplan yang .

Tidak seperti embriogenesis normal dalam vivo, in vitro percambahan hESCs tidak disertai oleh pembentukan lapisan yg mula-mula dan bertindak untuk menyekat homeotic Nohgenov latar belakang, iaitu, tanpa organogenesis. Sejak gen segmentasi tidak berfungsi dalam budaya hESCs mustahil untuk mengeluarkan semula apa-apa tempoh embriogenesis sebagai tab somite pembahagian nukleus, pembentukan kantung kuning, allantois organ dan tisu dilaksanakan dgn bersyarat dan lain-lain. ESC budaya dibekukan pada awal pembentukan 350 garis larangan sel khusus. Oleh itu, sel-sel leluhur anak klon dan PGC pusat setempat hanya embrio model semasa pembangunan di mana kawasan-kawasan tisu yang berbeza terbentuk dalam satu peringkat adalah berbeza daripada sel-sel khusus yang diperolehi, bagaimanapun, daripada peningkatan yang sama. Walaupun tahap minimum reseptor pada permukaan hESCs, mereka mengekalkan keupayaan untuk melaksanakan proses morphogenetic primitif simulasi sebahagian besar daripada struktur embrio awal: hESCs buburan dalam budaya dan agregat membentuk struktur yang menyerupai blastocyst atau lebih lewat embrio (silinder telur). Agregat penggantungan sedemikian sesuai dengan nama badan embrio yang ringkas dan kompleks.

Apabila dicampur membezakan ke dalam pelbagai sel-sel badan embrio pada masa yang sama dinyatakan oleh awal gen ektoderma (oct3, FGF-5, nod), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), mesoderm kardiogenik (PKH-2,5), tiub neural (msx3 ) dan hematopoiesis (elkf). Menggunakan pelbagai kombinasi cytokines dan faktor-faktor pertumbuhan untuk mensasarkan pembentukan sel-sel lapisan germa in vitro dalam beberapa kes ia adalah mungkin untuk mendapatkan badan embrio, yang sebaik-baiknya menyatakan gen ektoderma atau mesoderm, yang membuka jalan ke pemodelan grastulasi dan fasa organogenesis awal.

Pertumbuhan klon hESCs bukti pembahagian sel simetri di mana hanya salah satu daripada ESC di klon pusat mengekalkan kapasiti pembiakan bukan terhad, manakala sel anak yang lain menimbulkan penjanaan sel-sel leluhur, pembezaan sudah datang. Oleh itu, klon pembiakan kelajuan di pinggir badan embrio adalah lebih tinggi daripada di tengah. Sel sempadan klon berkembang menjalani spontan pembezaan bercelaru berhijrah atau mati oleh mekanisme apoptosis. Peristiwa-peristiwa ini menentukan nasib klon jika kadar percambahan melebihi kadar penghijrahan dan kematian sel apoptotic, klon saiz terus meningkat, penstabilan berlaku dengan apoptosis sama dan kadar pembentukan halaju sel baru, regresi - nisbah belakang proses ini. Sel-sel leluhur membahagikan simetri, iaitu, kedua-dua sel anak kemudiannya membezakan ke dalam bahagian sel khusus yang matang. Nisbah sel ESC / leluhur berbeza, tetapi sentiasa jumlah PSC adalah hanya sebahagian kecil daripada satu peratus daripada penduduk sel-sel leluhur. Oleh itu, hanya satu klon pipetting pengasingan yang teliti dan tepat pada masanya dapat meningkatkan bilangan ESCS dalam budaya. Klon pengasingan muncul dalam langkah 10-12 sel-sel yang paling berkesan untuk mendapatkan hESCs hasil maksimum. Arah dan tahap pembezaan sel-sel dalam badan embrio bergantung kepada lokasi mereka itu. Sel-sel badan embrio luaran tidak menyatakan gen dan oct4 menjalani pembezaan dalam sel-sel endoderm utama yang kemudiannya membentuk sel-sel epithelioid dan parietal extraembryonic endoderm visceral. Sel-sel badan embrio dalaman daftar oct4 mengekalkan gen pluripotency dan dalam tempoh 48 jam penanaman. Tetapi kemudian penyusunan semula morfologi berlaku dalam budaya monolayer epitelium bermula dan ungkapan gen yang mengawal pembangunan ektoderma utama. Di samping itu, proses daripada jumlah cytodifferentiation bercelaru bermula dengan kemunculan jenis sel yang berbeza yang boleh diambil dari ketiga-tiga lapisan germa. Dalam proses pembezaan spontan sel-sel badan embrio pertama timbul agregat penanda endoderm dalam bentuk serpihan (sista) yolk. Di samping itu, struktur ini muncul angioblasts dan berkembang sel-sel endothelial kapilari. Dalam peringkat akhir pembezaan spontan sel-sel dalaman badan embrio membangun pelbagai sel-sel dibezakan maut, termasuk neuron, unsur-unsur glial, cardiomyocytes, makrofaj dan eritrosit. Dalam anggaran tertentu (mengingati penyongsangan spatial kepingan membentuk tisu embrio) melalui badan-badan embrio in vitro boleh meneroka proses morphogenetic dan menganalisis mekanisme molekul cytodifferentiation embrio tempoh permulaan, dan mewujudkan peranan gen tertentu dalam pelaksanaan proses ini.

Oleh itu, dalam klon itu adalah sel-sel di mana program-program pembangunan genetik yang berbeza ditemui - ESC, progenitor awal dan membezakan populasi progenitor. Penanaman ESC dengan cara-cara drop drop atau budaya jisim tanpa lapisan feeder dan tanpa penambahan LIF dalam medium tidak dapat dielakkan membawa kepada pembentukan badan embrioid. Morfologi sel lapisan luar dan dalam badan embrio berbeza. Lapisan luar terdiri daripada sel-sel proses yang besar. Permukaan mereka, menghadapi alam sekitar, ditutup dengan banyak mikrovili. Lapisan luar sel-sel dipisahkan dari membran basal dalaman yang menyerupai membran Reichert, manakala sel-sel lapisan dalaman badan embrioid adalah epitel silinder. Morfologi, lapisan dalaman, walaupun mengandungi banyak sel-sel membahagikan, lebih mengesankan koloni ESC yang tidak dibezakan.

Ciri-ciri sel stem embrio manusia

Ketiadaan interaksi parenchymal-mesenchymal pada isyarat latar belakang menyekat gen homeosis menyebabkan pertumbuhan bercelaru PGC dalam budaya, kerana tab ini pecah dan infrastruktur pembentukan organ-organ dilaksanakan dgn bersyarat. Pertumbuhan tidak teratur dan pembezaan spontan senonoh hESCs dalam budaya kerana kekurangan mesenchymal menandakan rangka kerja stromal badan masa depan: in vitro ia adalah mungkin pembentukan juta hepatosit, tetapi anda tidak boleh mendapatkan mana-mana segmen hati, termasuk unsur-unsur struktur dan fungsi itu, seperti sinus, ruang sel Disse dan Kupffer.

Adalah dipercayai bahawa pluripotency daripada ESCS menyedari secara eksklusif di embriogenesis untuk membentuk tisu dan organ-organ embrio, manakala tali pusat dan plasenta diperolehi trophoblast. Dilampirkan dalam satu shell trofektodermalnuyu ESK konsisten menjana klon sel dilaksanakan dgn bersyarat merealisasikan program pembangunan oleh mRNA kombinasi pukal Nohteyaov matriks topografi, yang mentakdirkan susunan ruang, bentuk, dimensi, bilangan sel-sel organ sementara dan muktamad dan pemasangan parenchyma dalam unit struktur dan fungsi. Pada masa yang sama ESC adalah satu-satunya jenis sel di mana mekanisme molekul merealisasikan potensi mereka sepenuhnya dipisahkan dari program genetik pembangunan dan ESCOs sendiri dilucutkan kemungkinan interaksi dengan sel-sel lain kerana tersumbat kedua-dua persepsi reseptor dan sistem transsignalizatsii. Walau bagaimanapun, mencukupi ESCS pengaktifan keputusan dalam secara beransur-ansur penggunaan embriogenesis program berakhir lahir sepenuhnya dibentuk dan bersedia untuk hidup extrauterine organisma terdiri daripada berbilion-bilion sel. Dalam masa yang singkat ini, tetapi hutang tidak dapat dibayangkan di selular jalan ruang kejadian yang tidak dapat dielakkan kesilapan dalam mekanisme molekul yang menyediakan fungsi-fungsi utama sel-sel, dan dalam program-program yang mengawal percambahan, pembezaan dan pengkhususan mereka. Oleh itu, dalam farmakogenomik moden dipertimbangkan secara berasingan penyakit peranti molekul, sedangkan sel penyakit. Dan tindakan majoriti ubat-ubatan baru bertujuan untuk membetulkan nama program pembezaan, percambahan dan organogenesis, serta pertumbuhan semula organ-organ dan tisu. Dalam organisma dewasa melalui ESCS ia menjadi mungkin untuk mengawal kelakuan sel-sel stem / leluhur dipindahkan ke dalam otak, hati, limpa, sumsum tulang dan organ-organ lain manusia untuk membaiki penerima yang rosak organ parenchymal kerana pembezaan dan pengkhususan sel penderma mesenchymal dipelihara matriks. Pada dasarnya, program totipotency melancarkan lain oosit genom peringkat, zigot dan blastomer, tetapi sel-sel ini tidak lagi mungkin untuk mengklon dan passaged dalam kuantiti yang diperlukan untuk keperluan perubatan experiental dan praktikal. Oleh itu, ESC adalah satunya sumber maklumat genetik yang mengandungi tiga dimensi linear peta sekatan embrio dan kod bahagian sel khusus semasa grastulasi.

Hampir kemungkinan tanpa had regeneratif ESC disebabkan oleh hakikat bahawa genom mereka, berbeza dengan alat genetik sel somatik dibezakan, mengekalkan pluripotency. Satu manifestasi keadaan tidak aktif berakar umbi dalam ESCS maklumat genetik adalah phenotype minimum yang dipanggil - pada permukaan ESC untuk menyatakan bilangan yang terhad reseptor, dan oleh itu digunakan sangat sedikit program untuk berinteraksi peralatan nuklear transsignalizatsii sel dengan mikro itu. Terhadap latar belakang gen hibernasi bertanggungjawab bagi sekatan bahagian sel khusus dan pembezaan sel, diaktifkan hanya kira-kira 30 daripada 500 gen yang mana produk menyediakan sel-sel komunikasi dengan mikro sekitarnya. Menggunakan kaedah analisis siri gen menunjukkan bahawa keluasan kotak genom berfungsi utama yang mengawal selia tenaga dan metabolisme dalam sel-sel somatik dan ESCS dalam terakhir ditentukan jumlah yang sangat rendah mRNA reseptor, G-protein, utusan kedua, transcriptases, kofaktor bersuara dan penindasan iaitu, isyarat kawal selia sistem keseluruhan transmembran ke dalam sel. Ini adalah disebabkan oleh kekurangan atau gen ungkapan yang sangat rendah transsignalizatsii. Semasa pembezaan yang teraruh dalam genom ESC 18 operasi dihentikan serentak berfungsi gen untuk latar belakang pengaktifan transsignalizatsii 61 gen mengawal sintesis reseptor lekatan sel, komponen matriks extracellular, sekatan transcriptases elemen messendzhernyh dan sistem penghantaran isyarat yang unit nuklear dengan plasma reseptor membran sel. Pada masa yang sama disekat ungkapan gen yang bertanggungjawab untuk sintesis protein penyenyap, serta ekspresi gen koingibitorov menyediakan hESCs totipotency genom.

Penanda genetik ditemui untuk sel-sel ketiga-tiga risalah embrionik. Pengenalan lapisan sel ectodermal dijalankan ungkapan gen nod, oct3 dan FGF-5, sel-sel mesodermal - gen brachyury, zeta-globin, endoderm - sekurang-gata-4 gen. Dalam embriogenesis normal, semasa grastulasi diperhatikan penghijrahan yang aktif populasi tidak matang sel-sel stem dan leluhur, di dalam menetapkan bidang tulang muka tengkorak, beberapa bahagian otak, sistem saraf periferal, sistem pengaliran jantung dan tisu timus yang terbentuk dari klon pelarian sel. Sel pelabelan gen awal lapisan germa memudahkan analisis topografi penghijrahan sel-sel leluhur dalam embrio membangun. Ia didapati khususnya bahawa sel-sel dalam agregat embryocarcinoma P19 ungkapan brachyury gen mesoderm pertama bermula semasa pengurangan gen pengaktif tisu plasminogen, a-fetoprotein, keratin 8, dan keratin 19, yang penanda mesoderm awal penduduk berhijrah. Oleh itu, pembentukan tisu asal mesodermal bermula hanya selepas proses migrasi dan titik pengenapan sel mesodermal leluhur.

Dengan ciri-ciri fenotip sangat terhad dan ketiadaan sebahagian besar blok transsignalizatsii ESC namun menyatakan beberapa molekul reseptor yang boleh digunakan untuk mengenal pasti mereka. Perlu diperhatikan bahawa antigen penanda ESC pada manusia dan primat adalah biasa. Lebih digunakan untuk hESCs pelabelan dilabelkan antibodi kepada antigen membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (antigen lipid unik yang mewakili GL7 glycolipid kompleks dengan asid sialik), serta glycoproteins polimer tinggi TRA-1-81, TRA-1-60. Tambahan pula, hESCs daftar khusus antigen embrio SSEA-1 dan phosphatase alkali dalaman, serta faktor transkripsi tertentu Oct4. Yang terakhir ini diperlukan untuk mengekalkan hESCs mekanisme percambahan - faktor transkripsi tertentu Oct4 gen mengaktifkan ungkapan pertumbuhan fibroblast faktor 4 gen dan menstabilkan tinju bertanggungjawab bukan menghadkan pengulangan DNA dalam sel-sel tidak matang. Yang paling penting protein penanda intrasel adalah Oct3, Oct4, Tcf dan Groucho, yang berkaitan dengan protein chromatin-penyenyap.

Hampir serta-merta selepas jangka panjang berbudaya ESCS percubaan tidak berjaya dan organisma pertama kali disediakan oleh budaya sel stem diasingkan daripada blastocysts tetikus, dan budaya sel kuman utama, memulakan peringkat kajian kapasiti ESC pluripotency apabila diberikan pada peringkat awal perkembangan embrio. Ia telah menunjukkan bahawa di morula dan PGC blastocyst mampu untuk membentuk embrio kimera di mana keturunan PGC penderma dikesan dalam semua tisu somatik dan juga dalam gamet. Oleh itu, dalam Biologi Perkembangan menggunakan ESC skrip "jambatan" antara kajian eksperimen in vivo dan in vitro, yang ketara meningkatkan kemungkinan mengkaji proses Bookmarks tisu rendah dan organ-organ, perbezaan mereka dan organogenesis embrio.

Adalah menjadi pengetahuan umum bahawa dalam vivo semasa embriogenesis ESK bersepadu ke dalam jisim sel awal embrio, dan terbitannya terdapat dalam semua organ dan tisu. PGC menjajah talian kuman daripada sel-sel kuman kimera, keturunan yang membentuk telur penuh dan sperma. Sel stem embrionik adalah clonogenic - PGC tunggal boleh membuat genetik sama dengan sebuah koloni sel dengan penanda molekul, termasuk ungkapan oct4 gen dan phosphatase alkali, aktiviti telomerase tinggi, dan juga sebagai ungkapan antigen embrio tertentu.

Untuk mengkaji mekanisme embriogenesis menggunakan teknik hESCs chimerization morula dengan mewujudkan struktur biologi, yang terletak di luar lapisan blastomer tetraploid penerima dan penderma PGC ditadbir ke dalam. Oleh itu, trophoblast terbentuk daripada keturunan tetraploid blastomer penerima yang membolehkan implantasi dan plasenta, dan PGC penderma bertindak sebagai jisim sel dalaman, yang terbentuk daripada garis kuman berdaya maju badan dan leluhur gamet utama. Nilai kajian ESC bukan sahaja terletak pada itu, apabila manipulasi dalam vitro dengan genom mereka pluripotency dikekalkan, tetapi juga dalam fakta bahawa sambil mengekalkan keupayaan untuk mengambil bahagian dalam pembentukan sel-sel kuman hESCs primordial embrio kimera. Ia menunjukkan bahawa hanya satu keturunan PGC diubahsuai secara genetik menjajah semua kuman rendah dan membentuk kain embrio kimera diperolehi dengan mengumpul ikan atau coculture sel-sel dengan embrio 8-sel. Apabila dipindahkan ke dalam ESCS tikus morula transfected dengan gen protein pendarfluor hijau, keturunan pendarfluor sel ditemui dalam semua tisu disiasat embrio membangun (Shimada, 1999). Pemindahan daripada ESC dalam morula boleh membuat tikus yang berdaya maju, badan yang terdiri semata-mata keturunan menderma ESC, yang membuka peluang kepada pelbagai pilihan pengklonan terapeutik. Kini seperti pendekatan yang teratur telah berjaya digunakan untuk mengkaji masalah biologi pembangunan, khususnya, ia boleh menganalisis mekanisme genetik inactivation kromosom X atau ketidakstabilan epigenetik daripada hESCs. Pemindahan ESC ke embrio awal juga digunakan dalam bioteknologi dalam bidang pertanian, serta dalam eksperimen terapi gen.

Transplantasi ESC diubah suai secara genetik digunakan untuk menguji sel sasaran gen mutan. ESC berbudaya in vitro digunakan dalam bioteknologi untuk mencipta tikus kalah mati. Untuk tujuan ini, dengan penggabungan semula homolog yang akan dikeluarkan dari ESCS kajian gen (kalah mati) dan media terpilih merembeskan sel kekurangan gen ini. Kemudian knockout ESC disuntik ke dalam blastocyst atau digabungkan dengan blastomer morula. Embrio awal kimera itu didapati dipindahkan ke dalam penerima perempuan dan tikus yang baru lahir dipilih di kalangan individu yang mempunyai gamet, nullizigotnymi gen ini. Dengan teknologi ini, banyak tikus knockout telah dibuat, yang digunakan secara meluas dalam biologi percubaan dan ubat eksperimen. Pada model biologi mengkaji nilai gen tertentu dalam perkembangan embrio, serta peranan mereka dalam mekanisme penyakit dan keadaan patologi pada manusia. Di samping itu, garis-garis haiwan kalah mati digunakan dalam fasa ujian praplinasi kaedah terapi gen baru. Sebagai contoh, menggunakan transfection gen dalam ESK alel normal gen mutan manage berkesan diperbetulkan mutasi, menyerang sistem hemopoietic itu. Pengenalan gen asing ke ESCS membolehkan cepat membuat garisan homozigot haiwan makmal transgenik. Walau bagaimanapun, perlu diingat bahawa teknik diarahkan penggabungan semula gen penghapusan pasti diusahakan lagi hanya agak tikus ESC. Menggunakan ESCS murine kalah mati double dipasang fungsi kawasan peranan kelompok gen pada kromosom 7 (copy rantau genomik kromosom 19 minit manusia), dan bahagian proksimal kromosom ke-11 (salinan kromosom 5d manusia) - penghapusan gen ini dalam Tikus ESK dibenarkan untuk menilai fungsi analog mereka pada manusia.

Kajian fungsi kapasiti gen embrio manusia, transfection dalam gen yang haiwan makmal dibenarkan hESCs dalam crypto tertentu menjelaskan peranan gen dalam tab dan membentuk gen mesoderm kardiogenik, pax-6 - dalam embriogenesis mata. Merupakan ungkapan pertama gen dalam kad membiak tidak matang ESC teratocarcinoma dan tikus blastocyst mengesahkan penindasan yang amat menggalakkan dalam ESK gen transsignalizatsii. Gabungan ESCS mutan 60-80 dan 20-30 sel-sel embrio sebelum implantasi tetikus biasa membawa kepada perkembangan embrio kimera di mana penanda buku badan terdiri daripada sel-sel penderma dan penerima, yang membolehkan kita untuk menentukan peranan gen tidak diketahui di grastulasi dan organogenesis. Peta fungsi gen membangunkan embrio tetikus butiran diperbesarkan peranan gen tab sf-1 dalam kelenjar adrenal dan primordia kemaluan, wt-1 gen - di dalam buah pinggang tab myod gen keluarga - dalam tab otot gen keluarga rangka gata-1-4 - dalam kematangan sekatan asas-asas eritro- dan limfopoiesis.

Diarahkan off alel ibu dan bapa gen dalam hESCs menggunakan vektor recombinase berkhidmat untuk menjelaskan fungsi pelbagai gen semasa embriogenesis dan teknologi awal mensasarkan gen tidak diketahui manusia di ESCS tetikus menyumbang kepada penemuan gen mutan baru yang bertanggungjawab untuk pembangunan penyakit keturunan yang teruk. Menggunakan kaedah kalah mati ditakrifkan kepentingan obligat beberapa gen untuk meletakkan tisu embrio: gata-4 - untuk infarksi, gata-1 - untuk Erythroid tisu hemopoietic, myod - otot rangka, brachyury - untuk sekatan mesoderm transcriptases hnf3 dan hnf4 - untuk sel-sel stem hati, kain buruk-2 - penanda buku bagi klon T dan limfosit B (Repin, 2001). Penghapusan dua gen dalam hESCs telah membuka akses kepada pengajian peranan fungsi gen lapisan yg mula-mula, segmentasi dan homeosis dan pemindahan ESC diberikan kemungkinan mendapatkan berdaya maju embrio hibrid interspecific. Dengan kaedah yang lebih baik pemindahan PGC penderma dalam embrio 8-sel tunggal terbukti chimerization yang pada tahap sel daripada organ embrio penerima. Ambil perhatian bahawa pucuk sel dijumpai di dalam tisu organ penerima tikus manusia selepas pentadbiran sel stem hematopoietik manusia ke dalam blastocyst a. Ia telah mendapati bahawa dalam embrio tetikus semasa pembentukan badan-badan darah beredar hESCs pluripotent. Ia adalah mungkin bahawa fungsi biologi mereka adalah organisasi sistem imun janin masa depan. Dengan ESC in vitro semula model yang mencukupi penyakit genetik manusia: double model kalah mati dystrophin gen pada tikus daripada distrofi otot Duchenne, penutupan atm gen (kawalan isyarat sintesis kinase chromatin) - ataxia-teleangektaziyu. Dalam kes ini, penyakit keturunan maut pada kanak-kanak disebabkan oleh kecacatan dalam pembaikan DNA membangunkan kemerosotan sel-sel Purkinje dalam otak kecil, yang disertai oleh kesukaran daripada timus kerana kematian sel-sel membiak. Clinic, patofisiologi dan patomorfologija tazii ataxia-teleangek- diterbitkan semula melalui pengenalan ke dalam ESC maklumat genetik yang tidak normal dari chimeras tikus sesuai dengan mereka pada manusia. Tambahan pula ataxia-teleangektazii menggunakan PGC dan tikus kalah mati membangunkan model eksperimen, beberapa penyakit manusia homozigot keturunan yang dikaitkan dengan gangguan karbohidrat dan metabolisme lipid, katabolisme asid amino, penyingkiran tembaga dan bilirubin, yang ketara meningkatkan kemungkinan ubat bereksperimen untuk ujian pra-klinikal kaedah baru untuk merawat penyakit berkaitan hak.

[12], [13], [14], [15]

Penggunaan cytohybrid sel stem

Sel-sel hibrid diperolehi dengan menggabungkan sel-sel somatik daripada hESCs, adalah model yang mencukupi dan menjanjikan untuk belajar pluripotency sel stem dan reprogramming kromosom sel dibezakan. Tsitogibridy diperolehi oleh penggabungan ESC dengan sel-sel dibezakan haiwan dewasa, memberi peluang untuk mengkaji hubungan antara genom "zaman" yang berbeza: membangun keadaan yang unik di mana kromosom homolog yang diperolehi daripada sel-sel pelbagai peringkat pembezaan, dan pelbagai peringkat matang, berada di dalam nukleus yang sama, di mana mereka boleh dengan mudah transdeystvuyuschimi berkongsi isyarat peraturan. Ia adalah sukar untuk meramalkan bagaimana akan bertindak balas tsisregulyatornye sistem epigenetik kromosom homolog yang sedia ada semasa yn pembangunan yg dpt dibagi, sebagai tindak balas kepada isyarat kesan transdeystvuyuschih dari genom berkaitan embrio. Selain itu, dalam sel-sel hibrid berlaku pengasingan kromosom ibu bapa yang membolehkan untuk mengkaji interaksi genom di peringkat kromosom berasingan, iaitu, berpotensi mengenal pasti bahagian kromosom tertentu dalam penyelenggaraan pluripotency, atau Sebaliknya, output dalam pembezaan.

Sebagai model eksperimen yang pertama untuk mengkaji interaksi genom berbeza "sejarah perkembangan" yang digunakan tsitogibridy diperolehi dengan menggabungkan teratokartsinomnyh pluripotent dan sel-sel somatik berbeza. Dalam sesetengah kes, sel-sel hibrid tersebut mengekalkan sifat pluripotent pada paras yang cukup tinggi. Khususnya, dalam vivo hibrid somatik teratokartsinomno-sel-sel telah disebabkan pembangunan teratomas benar mengandungi derivatif ketiga-tiga lapisan germa, dalam vitro dalam budaya penggantungan membentuk badan embrio. Walaupun dalam jenis ini interspecies tsitogibridov berkata kehadiran antigen janin dalam kes-kes di mana rakan kongsi somatik dalam penggabungan itu dengan sel-sel teratocarcinoma adalah limfosit atau thymocytes. Perlu diperhatikan bahawa hibrida cyto yang diciptakan oleh gabungan sel teratokarsinoma dengan fibroblas sesuai dengan fibroblas mengikut fenotip.

Yang paling penting ialah fakta yang menetapkan bahawa dalam teratokartsinomno sel hibrid somatik muncul tanda-tanda genom reprogramming sel-sel dibezakan, ciri-ciri pengaktifan gen individu atau tidak aktif X kromosom rakan kongsi somatik. Oleh itu, hasil penyelidikan pada sel teratokartsinomno-somatik jenis tsitogibridah menunjukkan bahawa sel-sel hibrid sering tertangguh pluripotency dan reprogramming genom, terdapat tanda-tanda pasangan somatik.

Dalam uji kaji untuk mendapatkan embrio sel hibrid intraspesies oleh menggabungkan splenocytes dengan haiwan ESCS tetikus dewasa dikaji ciri-ciri tsitogibridov itu, analisis pengasingan kromosom ibu bapa dan dinilai genom pluripotency hibrid. Untuk sel-sel hibrid interspecific dihasilkan oleh sel-sel teratocarcinoma fusion dengan sel-sel somatik, secara amnya ciri-ciri pengasingan rendah kromosom dengan kariotip tetraploid atau hampir tetraploid. Susunan kromosom yang sama diperhatikan dalam cytohybrid oleh gabungan sel seks utama dengan limfosit. Pada masa yang sama, sel-sel hibrid interspecific diperoleh hasil daripada penggabungan tetikus limfosit teratokartsinomnyh sel cerpelai, terdapat pengasingan sengit kromosom rakan kongsi somatik.

Satu peringkat kualitatif baru dalam kajian pengasingan kromosom ibu bapa dalam kacukan interspecific datang selepas pembangunan kaedah analisis mikrosatelit menggunakan tindak balas rantai polymerase, di mana setiap kromosom tetikus mendapati beberapa ratus penanda, membenarkan dengan pasti membezakan antara mana-mana pasangan kromosom homolog dalam sel-sel hibrid.

Dengan menggabungkan ESK (menggunakan HM-1 sel-sel kekurangan aktiviti gipoksantinfosforiboziltransferazy, 2n = 40, XY, diasingkan daripada ketegangan blastocysts mouse 129 / 01a) dengan splenocytes dari tikus talian congenic DD / c gagal menerima set klon hibrid morfologi mempunyai persamaan dengan hESCs. Semua klon telah diasingkan pada media terpilih, di mana pertumbuhan adalah mungkin hanya dengan gipoksantinfosforiboziltransferazoy sel aktif. Analisis Electrophoretic mendedahkan kehadiran semua klon alel varian gipoksantinfosforiboziltransferazy tikus ciri DD / c. Menggunakan analisis sitogenetik, didapati bahawa empat mempunyai tiga klon hibrid okolodiploidny set kromosom. Satu hampir tetraploid klon terkandung dua populasi sel hibrid, satu daripadanya adalah tetraploid, dan kedua, yang lebih kecil - diploid.

Analisis mikrosatelit yang membolehkan untuk mendiskriminasi mana-mana pasangan kromosom homolog mouse 129 / 01a dan DD / c, dalam klon hibrid dengan set okolodiploidnym menunjukkan bahawa klon berlaku di dua berbeza penghapusan keutamaan rakan kongsi somatik autosom. Kebanyakan klon autosomal HESS2 dan HESS3 mempunyai penanda beratur 129 / 01a, iaitu, rakan pluripotent. Pengecualian adalah kromosom 1 dan I: klon HESS2 dan HESS3, bersama-sama dengan penanda HM-1 sel, sebilangan kecil penanda rakan kongsi somatik hadir. Keputusan ini boleh mencerminkan pengasingan lengkap kromosom 1 dan dan rakan somatik dan selaras dengan data sitogenetik yang trisomi kromosom yang berlaku pada 30-40% HESS2 dan klon sel HESS3. HESS4 klon berbeza dengan ketara dalam komposisi kromosom: banyak autosom klon ini berasal dari genom ESK (kromosom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 dan 17), tetapi kromosom 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 dan 19 diwakili oleh homolog kedua ibu bapa. Nisbah kuantitatif penanda mikrosatelit ini kromosom homolog mengenai kira-kira 1: 1. Ini membolehkan penulis untuk menunjukkan bahawa satu homolog berasal dari genom ESC dan lain - dari sel-sel dibezakan. Sebahagian subclones klon HESS4 diperhatikan hanya kehadiran tanda kromosom 18 dan 19 rakan kongsi somatik. Keputusan menunjukkan bahawa sel-sel klon HESS4, selain daripada pengasingan kromosom rakan kongsi somatik, terdapat penghapusan satu atau kedua-dua homologs daripada kromosom atas pluripotent genom, iaitu, terdapat pengasingan dua belah bahagian kromosom kedua-dua ibu bapa - fenomena yang agak luar biasa, kerana tsitogibridov pengasingan ciri kromosom sahaja salah seorang ibu bapa.

Di samping itu, selepas laluan ke-20, semua klon sel hibrid hanya mengandungi penanda kromosom X pekongsi somatik, iaitu, dalam klon digantikan X kromosom ESC pada kromosom X yang rakan kongsi somatik. Ini disahkan oleh data hibridisasi dalam menggunakan pecahan FITC khusus untuk kromosom X mouse: isyarat positif dikesan hanya pada satu kromosom. Perlu diingat bahawa pada peringkat awal penanaman (sehingga laluan ke-15), menurut data sitogenetik, dalam banyak sel terdapat dua kromosom X. Oleh itu, penggunaan media selektif memungkinkan untuk memanipulasi komposisi kromosom sel hibrida dan selektif sasaran klon yang membawa kromosom tunggal rakan kongsi somatik terhadap latar belakang genom ESC.

Sebagai ciri unik tsitogibridov genom adalah penyetempatan genom ibu bapa dalam teras tunggal, sudah tentu, menimbulkan persoalan mengekalkan sifat-sifat pluripotent genom embrio hibrid sel ESC-somatik dalam syarat-syarat hubungan yang rapat dengan genom sel-sel dibezakan. Morphologically, cyto hybrid ESC dan sel somatik menyerupai garis ibu bapa ESC. Kelayakan pluripotency menunjukkan bahawa semua klon okolodiploidnym set kromosom dapat membentuk dalam budaya penggantungan badan embrio di mana derivatif daripada tiga lapisan germa ini.

Kebanyakan sel hibrid mengandungi antigen ECMA-7, ciri penanda embrio tetikus awal, dan juga mempunyai aktiviti fosfatase alkali yang tinggi. Data yang paling meyakinkan mengenai sifat pluripotent tinggi sel hibrida diperolehi dalam eksperimen untuk mendapatkan satu siri suntikan chimeras yang melibatkan sel hibrid dari clone HESS2. Satu analisis penanda biokimia menunjukkan bahawa keturunan sel hibrid penderma didapati di kebanyakan tisu chimera. Oleh itu, sel-sel hibrid yang diperolehi oleh gabungan ESC dan sel-sel somatik yang berbeza mengekalkan pluripotensi pada tahap tinggi, termasuk keupayaan untuk membentuk chimera apabila dimasukkan ke dalam rongga blastokis.

Clones HESS2 dan HESS4 berbeza dengan ketara dalam komposisi kromosom induk, tetapi mereka mempunyai sifat pluripotent yang serupa. Seseorang akan menganggap bahawa plyuripotentnostv 'dalam genom hibrid menyatakan dirinya sebagai tanda dominan, tetapi ia adalah mungkin bahawa tidak semua kromosom genom embrio terlibat dalam penyelenggaraan pluripotency. Jika andaian ini benar, ia boleh dijangka bahawa penghapusan beberapa kromosom rakan kongsi pluripotent dari genom sel hibrid tidak disertai oleh perubahan dalam status pluripotent mereka. Dalam kes ini, analisis pengasingan kromosom ibu bapa dalam sel hibrida embrio akan membolehkan pendekatan yang dekat dengan identifikasi kromosom yang bertanggungjawab untuk mengawal pluripotensi sel-sel embrionik.

O. Serov dan co-authors (2001) tidak menemukan antara 50 keturunan yang diperoleh dengan melintasi chimeras dengan tikus normal, seperti yang akan mempunyai genotip tikus 129 / 01a dan membawa kromosom X tikus DD. Para pengarang melihat alasan ini dalam pengurangan pluripotensi dalam sel hibrid di bawah pengaruh genom somatik. Penjelasan alternatif mungkin adalah kesan negatif trisomi pada beberapa autosom dan ketidakseimbangan dalam kromosom seks (XXY diperhatikan dalam sel sebelum laluan ke-15) dalam sel hibrid apabila mereka melepasi meiosis. Adalah diketahui bahawa sel XXY tidak boleh melalui meiosis dan membentuk gamet. Trisomi juga dapat menyebabkan penurunan dalam aktiviti proliferatif sel-sel hibrid, hasilnya kelebihan selektif dalam perkembangan chimera boleh menjadi milik sel-sel embrio penerima. Oleh itu untuk menilai potensi pluripotent sel-sel hibrid, perlu mendapatkan klon hibrid dengan set kromosom diploid biasa.

Dalam eksperimen Serova O. Et al (2001) pertama menunjukkan kemungkinan memprogram semula X kromosom dalam genom sel sel hibrid somatik. Kesimpulan ini berikut dari penulis menganalisis ungkapan chimeras gen hprt (tanda X kromosom): kehadiran alel varian hprt DD / c tikus dikesan dalam semua tisu dianalisis kimera. Ia perlu ditekankan bahawa selepas pengenalan sel hibrid dalam rongga blastosista tsitogibridy jatuh dalam keadaan tidak terpilih dan pemeliharaan X kromosom dalam genom sel hibrid bermakna bahawa ia telah menjadi komponen obligat genom dan tidak mendiskriminasi dari Y pasangan kromosom pluripotent.

Merumuskan hasil analisis interaksi somatik dan pluripotent genom embrio dalam sel-sel hibrid, penulis membuat kesimpulan bahawa, tsitogibridah pluripotency tertentu muncul sebagai sifat dominan. Gen hibrid mampu kromosom individu reprogram sel-sel dibezakan, yang, bagaimanapun, tidak menghalang kesan terbalik pada pluripotency genom somatik genom embrio. Dalam penanaman sel hibrida, induksi pembezaan berlaku lebih kerap daripada di garis induk asal ESC NM-1. Kesan yang sama diperhatikan dalam pembentukan koloni primer: banyak koloni primer sel hibrida embrio membezakan di peringkat awal pembentukan dengan kehilangan besar klon semasa pemilihan dan pendaraban mereka.

Oleh itu, cytohybrides dicipta oleh gabungan ESC dengan sel-sel somatik, walaupun bersentuhan dengan genom sel yang dibezakan, memelihara pluripotency sebagai harta unik genom embrionik. Lebih-lebih lagi, dalam sel-sel hibrid tersebut, adalah mungkin untuk memprogram semula kromosom individu yang berasal dari sel yang diffused. Ia masih tidak jelas bagaimana sifat pluripoten genom embrio dalam sel hibrid kekal, khususnya, keupayaan mereka untuk mengambil bahagian dalam pembentukan jalur embrio di chimeras. Untuk ini, perlu mendapatkan sel hibrid embrio dengan karyotip biasa. Dalam mana-mana kes, pluripotent sel hibrid embrio boleh menjadi model sebenar untuk pengenalan genetik kromosom yang terlibat dalam penyelenggaraan pluripotency atau kawalan sebagai pengasingan dua hala kromosom ibu bapa berpotensi menyediakan peluang itu.

Tidak kurang menarik adalah fenomena kajian itu, yang Serov G. Et al (2001) ditakrifkan sebagai "memori kromosom." Dalam genom hibrid kromosom homolog dua konfigurasi alternatif: homolog somatik rakan kongsi apabila menjalani pembezaan, manakala homologs rakan kongsi pluripotent, proses ini hanya permulaan. Oleh itu, mengekalkan sifat pluripotent tinggi sel hibrid menunjukkan bahawa "pluripotent" homolog konfigurasi ESC agak stabil dalam genom hibrid, walaupun kesan faktor transdeystvuyuschih berpunca daripada rakan kongsi yang somatik. Ciri-ciri yang dinyatakan di atas untuk reprogramming dibezakan kromosom homolog genom semasa pembangunan chimeras tidak menolak kemungkinan bahawa peringkat pertama pembentukan in vitro dan pengkulturan tsitogibridov mereka mengekalkan status mereka yang diperolehi dalam masa pembezaan dalam vivo. Menurut data terkini, apabila memindahkan sel-sel hibrid embrio dalam medium bukan terpilih di mana terdapat satu kromosom penghapusan hanya rakan kongsi somatik intensif, iaitu, genom sel hibrid mudah mendiskriminasi homologs selepas budaya in vitro untuk 10-15 petikan. Oleh itu, sel-sel hibrid embrio mewakili model eksperimen menjanjikan untuk kajian bukan sahaja sifat-sifat asas genom embrio sebagai pluripotency, tetapi juga alternatif yang - pembezaan embrio.

Keberkesanan terapeutik embrio stem transplantation

Sebelum menganalisis keberkesanan terapi ESC transplantasi dan derivatif mereka, kita meringkaskan bahan di atas. Ciri-ciri ESC dari segi pelaksanaan penuh embriogenesis in vitro tidak mencukupi kerana kecacatan dalam kes ini kerana ketiadaan sel-sel stem mesenchymal yang berlaku di dalam badan secara autonomi dan bebas dari hESCs. Genetik potensi ESK kurang genetik zigot yang berpotensi oleh itu secara langsung untuk pengklonan embrio ESCS tidak digunakan. Potensi biologi unik ESC sebagai satu-satunya sel di mana program pembangunan dikerahkan secara berturut-turut ditemui dalam kajian mengenai fungsi gen. Menggunakan ESK dijalankan penyahkodan gabungan isyarat pertama yang mengaktifkan ungkapan gen awal dan akhir, pengekodan untuk pembangunan tiga lapisan germa. Memelihara genom pluripotency daripada ESCS in vitro menjadikan mereka alat yang unik untuk pembaikan semula yang secara automatik boleh mengimbangi kerugian sel organ dan tisu yang rosak. Dalam penjelmaan andaian ideal boleh menganggap bahawa "... Dalam pemindahan PGC penderma dalam organisma penerima dipindahkan program kemas dibungkus bahawa di bawah keadaan yang menggalakkan direalisasikan dalam pembinaan tkani'7 baru yang mampu" ... Berkesan disepadukan ke dalam badan penerima sebagai morfologi, kedua-duanya berfungsi dan berfungsi. "

Secara semulajadi, berikutan perkembangan kaedah untuk monodifferentiation ESC, kajian vivo mengenai aktiviti fungsi sel yang diperolehi dalam vitro dari satu klon khusus tunggal bermula. Klon ESO yang membesar menjana populasi sel-sel progenitor yang berpindah yang benar-benar mampu secara aktif mengintegrasikan ke dalam zon-zon kerosakan tisu penerima, yang digunakan dalam ubat plastik regeneratif. Telah ditubuhkan bahawa pemindahan Dopa-neuron dalam substantia nigra mengurangkan manifestasi klinikal dalam hemiparkinsonianisme eksperimen. Transplantasi serantau sel stem syaraf penderma mengurangkan tahap gangguan motor yang disebabkan oleh trauma atau pelepasan saraf tunjang dan otak. Diterima dan keputusan positif pertama pemindahan pemindahan stem dalam penyakit demamelinating. Nampaknya potensi-potensi plastik regeneratif ESCs membuka peluang tanpa had untuk menggunakan pemindahan selular dalam perubatan praktikal. Walau bagaimanapun, apabila pemindahan ke zon ektopik, ESC tidak dapat dielakkan berubah menjadi tumor. Apabila suntikan subkutan ESC dalam teratomas tikus immunodeficient terbentuk. Apabila pemindahan di bawah kapsul buburan ESK testis pada tikus syngeneic juga terbentuk teratomas terdiri daripada tisu yang berlainan, sel-sel yang derivatif ketiga-tiga lapisan germa. Dalam teratoma seperti itu, proses pengurangan organogenesis sangat jarang berlaku.

Sejumlah karya memberi maklumat mengenai hasil positif pemindahan pemindahan derivatif awal ESCO kepada haiwan dengan patologi bekas perimental. Neurotransplantation bimbit menggunakan derivatif PGC selanjutnya dibangunkan dalam eksperimen dan ujian klinikal pertama pada pembetulan gangguan fungsi di dalam otak dan saraf tunjang trauma, rawatan syringomyelia dan multiple sclerosis (Repin, 2001). Dengan adanya teknologi ESCS neyronogeneza dalam vitro, dan bukannya menggunakan teknik pemindahan tisu otak embrio dibangunkan derivatif neurospheres, yang diperolehi daripada budaya tisu neural embrio. Penggantungan pemindahan seperti itu lebih homogen dan mengandungi prekursor saraf dan neuroglia yang berkomitmen.

Selain medium budaya biasa dengan asid retinoic pada dos 10 ug / ml selama 6 minggu dalam barisan embrio (teratomas) NTERA-2 -kartsinomy manusia membentuk lebih 80% daripada neuron pasca mitosis. Kehomogenan lengkap penduduk neuron dicapai dengan aliran menyusun penanda immunophenotypic dilabel neuron matang yang boleh menyingkirkan sisa-sisa teratokartsinomnyh dan sel-sel tidak matang. Selepas pemindahan ke pelbagai kawasan otak haiwan eksperimen, neuron tersebut bukan sahaja dapat bertahan, tetapi juga dibina ke dalam rangkaian neural serantau. Pada haiwan dengan model eksperimen kecacatan tempatan CNS neurotransplantation mengurangkan manifestasi klinikal patologi manusia seperti kesan trauma craniocerebral, strok, penyakit demyelinating, keturunan kecacatan pembangunan cerebellar, penyakit pemendapan lipid dan polisakarida.

Untuk mengoptimumkan proses regenerasi dalam penyakit degeneratif sistem saraf pusat, teknologi untuk penyediaan oligodendrocytes penghasil myelin dari ESK sedang dibangunkan. Peringkat pertama secara tradisinya melibatkan percambahan ESCs dengan pendaraban bilangan sel yang diperlukan untuk transplantasi. Di peringkat kedua, diarahkan pembezaan sel ke dalam populasi prekursor oligodendrocyte yang menghasilkan myelin yang dijalankan, yang dikendalikan oleh antigen penanda selektif.

Beberapa prospek dibuka untuk kegunaan derivatif ESCS untuk membangunkan kaedah untuk pembetulan immunodeficiency disebabkan oleh kecacatan genetik dalam kematangan timus. Dalam kajian dalam kalah mati (kain buruk 1) tikus dengan kecacatan gen teraruh - pelanggaran mekanisme penggabungan semula V (D) J gen lokus TCR, yang membawa kepada kehilangan fungsi T-limfosit, pemindahan derivatif awal PGC dalam timus haiwan pulih kematangan populasi normal klon imun bertanggungjawab imuniti selular. Ujian klinikal pemindahan terbentuk terlebih dahulu dalam hESCs vitro untuk merawat anemia keturunan maut pada kanak-kanak.

Bantahan terhadap pengenalan pesat pemindahan stem ke klinik adalah dibenarkan oleh beberapa barisan sel induk embrionik manusia yang stabil dan keperluan bagi standardisasi mereka. Untuk meningkatkan kesucian garis ESC yang diseragamkan, serta sel stem dewasa, satu kaedah pemilihan garis berdasarkan analisis genetik molekul pengulangan pendek DNA yang dicadangkan. Ia juga perlu untuk menguji garis ESC untuk kehadiran penyusunan semula kromosom kecil dan mutasi genetik, potensi kemungkinan kejadian mereka di bawah keadaan penanaman sel cukup tinggi. Tesis memanjangkan wajib ujian sifat-sifat semua jenis PGC dan sel-sel stem pluripotent serantau, sejak pembiakan mereka dalam vitro boleh menimbulkan ciri-ciri baru tidak wujud dalam sel-sel stem embrio untuk muktamad atau tisu. Khususnya, ia diandaikan bahawa penanaman jangka panjang dalam media dengan cytokines Hess lebih dekat kepada sel-sel tumor, kerana ia berlaku laluan perubahan sama mengawal selia kitaran sel dengan pengambilalihan keupayaan untuk melaksanakan nombor yang tidak terhad pembahagian sel. Sesetengah penulis, berdasarkan potensi perkembangan tumor, mempertimbangkan pemindahan manusia derivatif awal sel embrionik sebagai kecacatan. Pada pendapat mereka, lebih selamat menggunakan keturunan ESC, yang merupakan garis keturunan nenek moyang sel yang dibezakan. Walau bagaimanapun, teknik yang boleh dipercayai untuk mendapatkan garisan sel manusia yang stabil yang membezakan arah yang betul belum dikembangkan.

Oleh itu, dalam kesusasteraan terdapat lebih banyak data tentang kesan terapeutik positif pemindahan trim derivatif sel embrionik manusia. Walau bagaimanapun, banyak karya ini tertakluk kepada semakan dan kritikan. Sesetengah penyelidik percaya bahawa keputusan percubaan klinikal awal adalah permulaan dan hanya mencadangkan bahawa sel stem boleh memberi kesan yang bermanfaat kepada kursus klinikal penyakit. Oleh itu, adalah perlu untuk mendapatkan data mengenai hasil jangka panjang pemindahan sel. Sebagai hujah, peringkat perkembangan neurotransplantologi klinikal diberikan. Malah, dalam kesusasteraan, pada mulanya dikuasai oleh penerbitan kecekapan yang tinggi daripada pemindahan otak serpihan embrio dalam penyakit Parkinson, tetapi kemudian mula muncul laporan menafikan keberkesanan terapeutik tisu neural embrio atau janin dipindahkan ke dalam otak pesakit.

Menjalankan ujian klinikal pertama menilai keselamatan pemindahan neuroblast - derivatif PGC NTERA-2 teratocarcinoma, sel-sel tidak matang yang berkembang dalam budaya tertakluk kepada simpanan 100 jisim sel sejuta. Sebahagian daripada sel-sel itu-yang diperolehi digunakan untuk menentukan ciri-ciri fenotip sel dan kekotoran, dan juga untuk menguji pencemaran yang berpotensi oleh virus dan bakteria. Dari medium budaya telah dibuang LIF dan lapisan feeder sel stromal dan syarat dicipta janin bagi pembezaan diarahkan hESCs ke neuroblasts dengan gabungan cytokines dan faktor-faktor pertumbuhan. Kemudian suci dari neuroblasts tidak matang teratocarcinoma sel oleh seorang tukang pilih sel aliran. Selepas penyucian kedua dan pencirian phenotype sel neuroblasts dipindahkan (10-12 juta) penggantungan menggunakan picagari dan microcannulas stereotaxy khas dan di bawah kawalan CT disuntik ke dalam basalis nukleus otak pesakit (bulan ketujuh selepas strok berdarah). Odnogodovoy selepas pemindahan saringan kesan pemindahan neuron dalam zon strok menurunkan sebarang kesan buruk dan tidak diingini. Separuh daripada pesakit mengalami peningkatan dalam fungsi motor dalam tempoh 6 hingga 12 bulan selepas pemindahan. Perubahan klinikal positif telah diiringi dengan peningkatan dalam zon strok bekalan darah selepas pemindahan sel: peningkatan penyerapan min pendarfluor dilabelkan 2-deoxyglucose, menurut positron pelepasan tomografi mencapai 18%, dan dalam sesetengah pesakit - 35%.

Walau bagaimanapun, Institut Kesihatan Nasional AS menjalankan kajian bebas mengenai keberkesanan klinikal neurotransplantasi pada pesakit Parkinson. Pesakit dalam kumpulan pertama ditransplantasikan dengan tisu saraf embrio yang menghasilkan dopamin, manakala kumpulan kedua pesakit menjalani operasi palsu. Hasilnya menunjukkan keberkesanan klinikal sifar neurotransplantasi itu, walaupun pada hakikatnya neuron-embrio menghasilkan dopamine terselamat di otak penerima. Selain itu, selepas 2 tahun selepas pemindahan tisu neural janin dalam 15% daripada pesakit yang dibangunkan dyskinesia berterusan, yang tidak ada dalam pesakit dalam kumpulan plasebo (Sel stem: kemajuan sains dan arah penyelidikan masa depan Kew Inst, Kesihatan Amerika Syarikat ...). Pemerhatian perkembangan lanjut penyakit ini berterusan.

Sesetengah penulis sifat kesusasteraan bercanggah pada penilaian data keberkesanan Neurotransplantation klinikal dengan pendekatan yang berbeza untuk pemilihan pesakit kumpulan, pilihan yang tidak mencukupi kaedah objektif untuk menilai keadaan mereka dan yang paling penting, syarat berbeza pembangunan tisu saraf janin dan di bahagian-bahagian berbeza otak yang fabrik dihasilkan dalam pelbagai saiz pemindahan dan ciri-ciri kaedah pembedahan.

Perlu diingatkan yang cuba untuk mengarahkan pemindahan sel stem embrio pluripotent di rantau ini striatal otak tikus dengan eksperimen gemiparkinsonizmom badan disertai ESC proliferasi dan pembezaan mereka ke dalam neuron dopaminergic. Ia mesti dianggap bahawa neuron baru ditubuhkan berkesan dibina ke dalam rangkaian neuron sebagai ESCS selepas pemindahan diperhatikan pembetulan anomali tingkah laku dan asimetri motor dalam ujian Apomorfina. Pada masa yang sama, beberapa haiwan mati akibat transformasi ESK yang dipindahkan di tumor otak.

Pakar-pakar daripada Akademi Negara dan Perubatan Amerika Syarikat, pakar daripada Institut Kesihatan Kebangsaan percaya bahawa potensi klinikal hESCs memerlukan perhatian yang serius, bagaimanapun, menegaskan mengenai keperluan untuk kajian terperinci sifat-sifat mereka, kemungkinan komplikasi dan kesan jangka panjang dalam eksperimen dengan model biologi yang mencukupi penyakit manusia (Sel stem dan ubat regeneratif masa depan Akademi Akademi Kebangsaan, Sel stem dan arah penyelidikan masa depan., Nat. Inst, Kesihatan Amerika Syarikat).

Dari sudut pandangan ini adalah penting bahawa analisis histologi perbandingan teratoma eksperimen yang diperoleh oleh pemindahan dalam testis PGC buburan dengan teratomas yang telah dibangunkan disebabkan oleh pemindahan awal embrio, yang termasuk juga hadir ESC menunjukkan bahawa ESK tanpa mengira asal atau interaksi mereka dengan oleh mereka atau sel-sel lain di sekitarnya dengan cara yang sama menyedari potensi tumorigenic mereka. Ia membuktikan bahawa teratomas itu mempunyai asal klon, kerana dari ESCS tumor mungkin berlaku, yang terdiri daripada terbitan ketiga-tiga lapisan germa (.Rega, 2001). Perlu diperhatikan bahawa apabila dipindahkan ke dalam tikus immunodeficient diklon PGC dengan kariotip biasa dan teratomas dibentuk yang terdiri daripada pelbagai jenis sel somatik berbeza. Data eksperimen ini adalah bukti sempurna dari asal klonal teratom. Dari perspektif biologi perkembangan, mereka mencadangkan bahawa ia tidak boleh dibahagikan dengan sel-sel leluhur komited dan pengenalan sel stem pluripotent adalah sumber derivatif dibezakan ketiga-tiga lapisan germa, komponen teratoma. Walau bagaimanapun, dalam praktikal keputusan pemindahan sel kajian ini adalah, jika tidak terlalu tinggi, maka tanda amaran potensi bahaya, sejak ESC inokulasi atau sel-sel kuman asal dalam tisu yang berbeza tikus immunodeficient dewasa tidak dapat tidak menyebabkan perkembangan tumor dari sel-sel stem dipindahkan. Degenerasi neoplastic ectopically dipindahkan ESC disertai dengan kemunculan populasi satelit sel-sel yang berbeza - dengan sebahagiannya membezakan sudah pasti ESCS dan klon leluhur talian khusus. Adalah menarik bahawa hESCs pemindahan dalam sel-sel otot rangka berhampiran teratokartsinomnymi neuron membentuk lebih kerap. Walau bagaimanapun, dalam PGC mentadbir Mace telur atau blastocyst disertakan dengan integrasi penuh dalam sel-sel kuman tanpa pembentukan sel-sel neoplastic. Pada masa yang sama ESC tertanam dalam hampir semua organ dan tisu embrio, termasuk kelainan seksual. Haiwan allofennye seperti pertama kali disediakan dengan menundukkan sel teratocarcinoma 129 pada peringkat awal embrio di 8-100 sel. Dalam allofennyh populasi tikus geterogenomnyh sel yang diperolehi PGC penderma diperkenalkan ke dalam sum-sum tulang, usus, kulit, hati dan kemaluan, yang membolehkan anda untuk membuat dalam eksperimen walaupun interspecies chimeras sel. Yang lebih kecil masa awal embrio, semakin tinggi peratusan chimerization sel, chimerization memastikan rasa diperhatikan dalam sistem hematopoietik, kulit, sistem saraf, hati dan usus kecil embrio allofennogo. Dalam organisma dewasa tisu chimerization yang yg setuju dilindungi daripada pendedahan kepada sistem imun halangan penerima gistogematicalkie: pemindahan primordial sel-sel kuman dalam parenchyma testis disertai dengan memasukkan sel penderma stem ke dalam lapisan penerima tisu germenativny. Walau bagaimanapun, ESC pemindahan ke dalam pembentukan blastocyst kemaluan primordia kimera dengan generasi penderma sel-sel kuman asal tidak berlaku. ESC pluripotency semasa membuat syarat-syarat khas dan boleh digunakan untuk pengklonan: ESC pemindahan tikus 8-16 sel tetikus embrio, mitosis sel mana tsitokalazinom disekat, menyumbang kepada embriogenesis biasa dengan pembangunan PGC embrio penderma.

Oleh itu, alternatif adalah pemindahan daripada allogeneic ESC pengklonan terapeutik berdasarkan sel somatik pemindahan nuklear ke dalam oosit enucleated untuk mewujudkan jisim sel dalaman blastocyst yang kemudiannya diperuntukkan garis PGC penderma genetik yang serupa nukleus somatik. Secara teknikal, idea ini boleh dilaksanakan, kerana kemungkinan penciptaan baris hESC dari blastocysts diperolehi selepas pemindahan nukleus somatik ke dalam sel telur enucleated berulang kali dibuktikan dalam eksperimen ke atas haiwan makmal (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Khususnya pada tikus homozigot untuk rag2 mutasi, fibroblas diperolehi oleh pengkulturan sel-sel tisu subepidermal telah digunakan sebagai nukleus penderma dipindahkan ke dalam oosit enucleated. Selepas pengaktifan, oosit "zigot" berbudaya sehingga pembentukan blastocyst, dari jisim sel dalaman adalah PGC terpencil dan lulus mereka ke dalam satu barisan untuk sel-sel gen nullizigotnyh mutan (rag2 ~ / ~). Dengan penggabungan semula homolog dalam ESC tersebut, mutasi satu gen allelik telah diperbetulkan. Dalam siri pertama eksperimen dari hESCs gen rekombinan pulih badan embrio disediakan, transfected sel daripadanya dengan retrovirus rekombinan (HoxB4i / GFP) dan selepas pembiakan tikus disuntik urat rag2 ~ / ~. Dalam siri kedua, tetraploid blastomeres diagregat dengan ESC diubah suai secara genetik dan dipindahkan ke penerima wanita mereka. Tikus immunocompetent yang dilahirkan sebagai penyumbang sumsum tulang untuk pemindahan kepada tikus mutan rag2 ~ / ~. Dalam kedua-dua siri ini, keputusannya adalah positif: dalam 3-4 minggu semua tikus dewasa didapati memiliki sel normal myeloid dan limfoid normal yang mampu menghasilkan imunoglobulin. Oleh itu, pemindahan ke dalam nukleus oosit sel somatik boleh digunakan bukan sahaja untuk menghasilkan garisan hESC, tetapi juga untuk tsitogenoterapii - Pembetulan keabnormalan keturunan menggunakan ESC sebagai vektor untuk pengangkutan membetulkan maklumat genetik. Tetapi dalam arah pemindahan sel ini, selain daripada masalah bioetika, terdapat batasan. Ia tidak jelas bagaimana selamat pemindahan itu akan terapeutik klon sel dengan genotip yang sama dengan genotip pesakit tertentu, kerana sel-sel itu boleh memperkenalkan mutasi yang mewujudkan kecenderungan untuk penyakit tertentu. Telur manusia biasa kekal objek tidak boleh diakses, sedangkan walaupun pemindahan nukleus somatik ke dalam oosit haiwan enucleated hanya 15-25% kejuruteraan "zigot" membangunkan ke peringkat blastosista. Ia tidak menentukan berapa banyak blastocyst diperlukan untuk memperoleh satu ESCs clone pluripoten yang diklonkan. Ia harus diperhatikan dan tahap kos kewangan yang tinggi yang berkaitan dengan kerumitan metodologi klon terapeutik.

Kesimpulannya, dalam pluripotency genom ESC hypomethylated DNA digabungkan dengan aktiviti telomerase tinggi dan fasa C ^ kitaran sel pendek, yang memastikan pendaraban intensif dan berpotensi terhingga, di mana PGC mengekalkan kromosom diploid dan "juvana" set ciri-ciri fenotip. Pertumbuhan klon PGC dalam budaya tidak menghalang mereka membezakan ke dalam mana-mana sel khusus organisma pada percambahan stop serta urusan tambah isyarat kawal selia yang sesuai. Sekatan pembezaan hESCs selaras dalam sel somatik vitro direalisasikan tanpa penyertaan mesenchyme, tanpa melalui Nohteyaov, adalah organogenesis dan tanpa pembentukan embrio. Pentadbiran ECopic ESC dalam vivo tidak dapat dielakkan membawa kepada pembentukan teratocarcinomas. ESC pemindahan menjadi blastocyst atau embrio awal disertakan dengan integrasi mereka dengan tisu embrio dan badan-badan chimerization stabil.

Penjanaan semula dan plastik teknologi berdasarkan pemindahan sel adalah titik persimpangan kepentingan ahli biologi sel, biologi pembangunan, genetik eksperimen, imunologi, neurologi, kardiologi, hematologi, dan banyak lain-lain bidang perubatan eksperimen dan praktikal. Keputusan eksperimen paling penting membuktikan kemungkinan memprogram semula sel-sel stem dengan arah perubahan sifat-sifat mereka, yang membuka prospek untuk mengawal proses cytodifferentiation dengan faktor-faktor pertumbuhan - untuk pertumbuhan semula miokardium, pemulihan luka CNS dan memulihkan fungsi radas pulau kecil pankreas. Walau bagaimanapun, meluas derivatif pengenalan pemindahan ESC dalam amalan perubatan adalah perlu untuk mengkaji ciri sel-sel stem manusia dengan lebih terperinci dan eksperimen lagi dengan PGC dalam model eksperimen penyakit.

Isu bioetika dan masalah penolakan pemindahan sel allogeneic dapat menyelesaikan keplastikan yang diperhatikan genom sel-sel stem dewasa serantau. Walau bagaimanapun, maklumat awal ialah apabila pemindahan hati sel hematopoietic autologous terpencil dan teliti ciri-ciri, di mana terdapat hepatosit baru, menggabungkan ke dalam lobul hati, kini sedang dikaji dan dikritik. Walau bagaimanapun, yang diterbitkan data bahawa pemindahan sel stem neural dalam timus ialah pembentukan pucuk baru penderma T dan B-limfosit, dan pemindahan sel stem neural otak dalam sum-sum tulang yang membawa kepada pembentukan hematopoietic kuman dialami penderma mieloid dan erythropoiesis . Oleh itu, dalam organ-organ dewasa dapat dikekalkan sel-sel stem pluripotent mampu genom reprogramming ESC untuk kapasiti.

Sumber ESCS untuk kegunaan perubatan masih embrio manusia, yang menentukan terlebih dahulu tidak dapat dielakkan daripada lintasan baru satu isu moral, etika, moral, undang-undang dan agama pada asal-usul kehidupan manusia. Penemuan ESC memberikan dorongan kuat untuk menyambung semula perbincangan yang keras tentang di mana garis antara sel-sel hidup dan materi, bahan dan personaliti terletak. Pada masa yang sama, tidak ada norma, peraturan dan undang-undang yang universal mengenai penggunaan ESC dalam bidang perubatan, walaupun terdapat percubaan berulang untuk mencipta dan menerima mereka. Setiap negeri dalam undang-undangnya menyelesaikan masalah ini dengan sendirinya. Bagi sebahagian mereka, pakar perubatan di seluruh dunia terus cuba untuk membawa perubatan regeneratif, plastik selepas perbincangan tersebut, terutamanya disebabkan oleh penggunaan sel stem bukan embrio dan batang rizab sel dewasa.

Beberapa sejarah pengasingan sel induk embrionik

Terato- (embrio) sel-sel telah diasingkan daripada -kartsinomnye secara spontan berlaku testis teratomas tetikus strain 129 sel / ter-Sv, spontan ovari garis teratomas tetikus Lt / Sv, dan dari teratomas, sumber ektopichno telah dipindahkan atau tisu embrio. Antara itu diperolehi terato- garis stabil tetikus (embrio) -kartsinomnyh beberapa sel-sel pluripotent, yang lain tertakluk kepada perbezaan hanya dalam sel-sel satu jenis tertentu, dan ada yang secara umum tidak berupaya untuk cytodifferentiation.

Pada masa itu, tumpuan adalah penyelidikan yang menunjukkan pulangan terato- mungkin (embrio) sel-sel -kartsinomnyh untuk phenotype normal selepas pengenalan mereka dalam tisu embrio membangun, dan kerja-kerja untuk mewujudkan dalam vitro terato- diubahsuai secara genetik (embrio) -kartsinomnyh sel-sel, dengan bantuan yang mana tikus mutan telah diperolehi untuk pemodelan biologi patologi keturunan manusia.

Penanaman penggantungan yang dianggarkan digunakan untuk mengasingkan sel-sel teri embrio-karsinoma. Dalam terato- kebudayaan (embrio) -kartsinomnye sel-sel, seperti ESCS, berkembang untuk membentuk badan embrio dan memerlukan untuk diterjemahkan ke dalam garis penceraian mengikat mengekalkan pluripotency pada lapisan feeder fibroblas embrio atau pengkulturan penggantungan dalam media dingin. Terato- sel pluripotent (embrio) - garis carcinoma besar, bulat, mempunyai aktiviti yang tinggi phosphatase alkali, agregat bentuk dan mampu pembezaan multidirectional. Apabila diperkenalkan ke blastocyst yang diagregatkan dengan morulae, menyebabkan pembentukan embrio kimera, dalam pelbagai organ dan tisu yang derivatif mendapati terato- (embrio) sel-sel -kartsinomnyh. Walau bagaimanapun, sebahagian besar embrio kimera seperti mati dalam utero, dan organ-organ yang masih hidup chimeras sel-sel asing yang baru lahir dan jarang dikesan dengan kepadatan yang rendah. Pada masa yang sama kejadian tumor (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, dan lain-lain jenis bengkak malignan dan adenoma Pankreas) mendadak meningkat, dan degenerasi neoplastic sering berlaku walaupun dalam utero embrio kimera.

Kebanyakan sel-sel terato-embrio-karsinoma dalam persekitaran mikro sel-sel embrionik yang normal hampir secara semula jadi memperolehi ciri-ciri neoplastik yang ganas. Adalah dipercayai bahawa keganasan tidak dapat dipulihkan adalah disebabkan oleh pengaktifan proto-onkogen dalam proses penyusunan semula struktur. Satu pengecualian adalah bahagian sel embriokartsinomnoy SST3, teratoma diperolehi daripada testis murine (line 129 / Sv-ter), yang mempamerkan keupayaan yang tinggi untuk mengintegrasikan ke dalam tisu dan organ-organ janin tanpa pembentukan berikutnya tumor pada tikus kimera. Derivatif sel-sel karsinoma terato-embrio-karsinoma di tikus chimera secara praktikal tidak mengambil bahagian dalam pembentukan gonosit utama. Jelas sekali, ia adalah berkaitan dengan kekerapan yang tinggi aberasi kromosom biasa kepada kebanyakan terato- (embrio) garis -kartsinomnyh di mana sel diperhatikan sebagai aneuploidy atau kromosom anomali.

Beberapa baris terato- stabil (embrio) sel manusia -kartsinomnyh telah disediakan di bawah keadaan makmal, ciri-ciri pluripotency, aktiviti proliferatif tinggi dan keupayaan untuk membezakan budaya semasa pertumbuhan. Khususnya, terato- talian (embrio) -kartsi- holonomik NTERA-2 sel-sel manusia yang digunakan untuk mengkaji mekanisme cytodifferentiation neural. Selepas pemindahan, sel-sel garis ini di rantau ini subventricular daripada otak depan tikus yang baru lahir dan penghijrahan mereka diperhatikan neyronogenez. Terdapat walaupun cuba untuk pemindahan terato- neuron diperolehi oleh pengkulturan sel (embrio) -kartsinomnoy talian NTERA-2, untuk pesakit dengan strok, yang, menurut penulis, yang membawa kepada peningkatan klinikal penyakit ini. Pada masa yang sama, kes-kes sel pemindahan yang teruk pada garis terato-embrio-carcinoma NTERA-2 tidak diperhatikan pada pesakit dengan strok.

Baris pertama sel-sel stem embrionik dibezakan pluripotent tikus pada awal 80-ies abad yang lalu mendapat Evans dan Martin, dengan memilih mereka daripada jisim sel dalaman blastocyst yang - embryoblast. Garis ESC terpencil untuk jangka panjang dipelihara pluripotency dan keupayaan untuk membezakan ke dalam pelbagai jenis sel di bawah pengaruh faktor-faktor dari medium budaya khusus.

Istilah "embrio sel stem pluripotent" kepunyaan Leroy Stevens bahawa penyiasatan kesan tembakau tar kepada kekerapan pembangunan tumor menarik perhatian kepada berlakunya teratocarcinoma spontan testis linear (129 / v) tikus daripada kumpulan kawalan. Sel teratocarcinoma testis telah disifatkan oleh kadar percambahan yang tinggi, dan dengan kehadiran cecair kiri dalam rongga abdomen dengan pembentukan pembezaan spontan neuron, keratinosit, kondrosit, cardiomyocytes, serta rambut dan tulang serpihan, tetapi tanpa sebarang tanda-tanda yang cytoarchitectonics lebih awal tisu sesuai. Apabila penanaman dalam budaya sel teratocarcinoma berkembang terikat kepada klon pluripotent substrat dan badan-badan embrio terbentuk kemudiannya dipadamkan dan tertakluk kepada spontan pembelahan senonoh membezakan ke dalam neuron, glia, sel-sel otot dan cardiomyocytes. Stevens mendapati bahawa teratocarcinoma mouse 129 / v mengandungi kurang daripada 1% daripada sel-sel mampu membezakan ke dalam pelbagai talian somatik khusus, dan sendiri pembezaan bergantung kepada faktor-faktor yang memberi kesan kepada mereka (komposisi cecair peritoneal, produk ditambah kepada budaya sel-sel matang atau tisu). Leroy Stevenson andaian mengenai kehadiran di kalangan sel-sel teratocarcinoma leluhur embrio sel-sel kuman seksual telah disahkan: penggantungan embryoblast sel-sel embrio preimplantation dalam tisu tetikus dewasa teratocarcinoma dibentuk, dan dipisahkan dari mereka bahagian sel tulen selepas pentadbiran intraperitoneal kepada haiwan penerima telah dibezakan ke dalam neuron, cardiomyocytes dan kletki somatik lain derivatif ketiga-tiga lapisan germa. Dalam eksperimen dalam pemindahan vivo ESK (yang diperolehi daripada embryoblast tetapi tidak trophoblast) dalam embrio tetikus di pelbagai peringkat baris 8-32 blastomere kelahiran berakhir haiwan kimera (tiada pembentukan tumor) dalam organ-organ yang mengesan tisu pucuk penderma. Chimerism diperhatikan walaupun pada garis sel seks.

Sel-sel kuman leluhur utama diasingkan daripada tetikus embrio seks kuman, morfologi, phenotype imunologi dan ciri-ciri fungsi selaras dengan hESCs berasal dari teratocarcinoma Stevenson dan embryoblast. Pada chimeras lahir selepas pentadbiran hESCs ke blastocyst yang, allofenny morfogenesis organ dicirikan penderma seli mozek dan penerima struktur dan unit fungsi hati, paru-paru dan buah pinggang. Dalam beberapa kes, pembentukan usus usus atau lobulus hati, yang terdiri serentak dari sel penerima dan penderma, diperhatikan. Walau bagaimanapun, pelaksanaan morfogenesis sentiasa berlaku pada program genetik bentuk, yang dipunyai oleh penerima, dan chimerism adalah terhad disebabkan oleh tahap selular.

Kemudian, ia telah mendapati bahawa percambahan hESCs tanpa cytodifferentiation pada sel-sel mesenchymal lapisan yang diperolehi feeder (fibroblas janin) berlaku di hadapan LIF mengikat dalam media nutrien terpilih yang terpilih menyediakan hanya survival sel-sel stem dan leluhur, manakala sebahagian besar unsur-unsur sel khusus mati. Dengan bantuan teknik pada tahun 1998 oleh James Thomson telah diperuntukkan lima baris diabadikan sel-sel stem embrionik daripada jisim sel dalaman seseorang blastocyst. Pada tahun yang sama, John Gerhart telah membangunkan satu kaedah mengasingkan garis ESC abadi dari puff seksual embrio manusia empat hingga lima minggu. Oleh kerana sifat-sifat uniknya, hanya dua tahun kemudian embrio sel stem dan sel stem tisu muktamad telah mula digunakan dalam amalan perubatan regeneratif dan terapi gen.