Sel stem embrionik

Penemuan sel stem embrio tidak timbul secara kebetulan, tetapi muncul di atas dasar penyelidikan saintifik yang disediakan dalam bidang biologi perkembangan. Istilah "sel stem" diperkenalkan ke dalam bidang perubatan pada tahun 1908 di kongres masyarakat hematologi di Berlin oleh Alexander Maximov berhubung dengan sel hematopoietik. Lama sebelum pengasingan dan pengeluaran garisan stabil sel stem embrionik pluripoten, sel terato-(embrio-karsinoma) stem telah digunakan dalam kajian proses pembangunan awal, dengan bantuan mekanisme embriogenesis yang tidak diketahui telah dikaji, termasuk urutan ekspresi gen awal dan produk protein aktiviti mereka.

Tetapi adakah totipotensi genom manusia tidak dapat dipulihkan dalam proses evolusi? Tidak, dan embriogenesis adalah bukti ini. Jika demikian, maka bilakah, pada dasarnya, jalan kedua pembangunan evolusi dapat direalisasikan? Mungkin, apabila manusia memasuki ruang angkasa, di mana keadaan persekitaran akan agak tetap untuk masa yang cukup lama. Kehilangan tisu tulang (penyahmineralan tulang dalam keadaan tanpa berat), yang sangat perlahan tertakluk kepada pembentukan semula dan penjanaan semula, boleh dianggap sebagai langkah pertama dalam proses penyesuaian manusia, sebagai spesies, kepada kewujudan dalam keadaan angkasa. Walau bagaimanapun, harga untuk laluan kedua pembangunan evolusi akan berbeza - harga untuk pengembalian totipotensi dan keplastikan mutlak kepada semua sel adalah kemandulan. Jadi, dalam dunia "bunglon evolusi" ini, kita perlu membiak tanpa meiosis, dengan bertunas. Tetapi kita akan hidup lama. Keabadian telomerase ialah keabadian amuba. Dalam organisma multiselular, sel stem adalah substrat jangka hayat kuantitatif dan kualitatif.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

Sumber sel stem embrionik

Hari ini, sumber sel stem embrio untuk penyelidikan makmal ialah garis teratokarsinoma tikus (129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Rl, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) dan teratokarsinoma manusia (NTERA-2, TERA-2, H-9 klon ESC), serta garisan Traune ESC. Walau bagaimanapun, ketersediaan pasport sel terperinci yang menunjukkan fenotip imun, hasil analisis kromosom, profil ekspresi mRNA, reseptor terdedah dan protein isyarat intraselular tidak mengimbangi kelemahan ketara garisan ESC teratokarsinoma - kehilangan totipotensi yang cepat dan kemustahilan menggunakannya dalam ujian klinikal, manakala pembezaan bercampur-campur dalam kultur sel yang sangat sukar untuk diasingkan. Oleh itu, sumber garisan ESC yang dicipta untuk tujuan klinikal biasanya adalah jisim sel dalaman blastokista, blastomer individu bagi embrio peringkat 8 sel, sel morula peringkat kemudian, serta sel kuman primordial.

Perlu diingatkan bahawa sel teratokarsinoma, walaupun mereka mempunyai sifat pluripotensi, dicirikan oleh potensi pluripoten yang jauh lebih rendah berbanding ESC. Penyepaduan mereka dengan sel embrio jarang membawa kepada pembentukan chimera, yang, lebih-lebih lagi, tidak pernah membentuk gamet dengan genotip sel teratokarsinoma. Adalah dipercayai bahawa ini disebabkan oleh keabnormalan kromosom yang kerap berlaku semasa penanaman sel teratokarsinoma: kehilangan kromosom Y, pelbagai trisomi, penghapusan atau translokasi.

Percubaan untuk mengasingkan talian ESC manusia telah dibuat berulang kali, tetapi tugas ini tidak dapat diselesaikan, kerana blastokista manusia biasa sukar diakses. Di samping itu, kekerapan keabnormalan kromosom pada manusia adalah lebih tinggi daripada embriogenesis haiwan. Sebilangan besar embrio manusia awal yang diperoleh selepas persenyawaan in vitro mempamerkan mozek kromosom yang huru-hara dan selalunya mempunyai penyimpangan berangka dan struktur. Malah kemudian, pada peringkat blastokista, hanya 20-25% daripada embrio manusia terdiri daripada sel dengan karyotype normal. Hampir mustahil untuk menggunakan embrio sedemikian untuk mencipta ESC, kerana zigot biasanya dibiakkan ke peringkat dua atau empat blastomer dan kemudian dipindahkan ke dalam rahim. Hanya baru-baru ini teknik yang boleh dipercayai untuk membiak telur manusia yang disenyawakan ke peringkat blastokista telah dibangunkan. Pengenalan teknik ini ke dalam amalan persenyawaan in vitro bukan sahaja meningkatkan kekerapan hasil implantasi yang berjaya, tetapi juga telah menjadikan blastokista biasa sebagai objek yang lebih mudah diakses.

Satu lagi sumber sel stem pluripoten ialah sel germa primordial, yang, tidak seperti populasi progenitor yang lebih maju bagi epitelium germinal, tidak mempunyai beta-integrin pada permukaannya, tetapi menyatakan aktiviti fosfatase alkali yang tinggi. Perlu diingatkan bahawa populasi sel stem yang terbentuk daripada sel kuman primordial telah dikaji secara eksperimen sejak tahun 1980-an. Pada masa itu, teknik untuk mengasingkan sel kuman primordial daripada asas gonad embrio tikus telah dibangunkan. Keputusan pertama yang tidak berjaya dalam pengkulturan sel kuman primordial secara in vitro mencadangkan kesia-siaan percubaan ini, kerana sel-sel itu, walaupun mereka terselamat, tidak membiak dan mati dalam hari pertama. Ia kemudiannya ditubuhkan bahawa sel-sel kuman primordial tikus membiak secara in vitro hanya dengan kehadiran faktor pertumbuhan polipeptida spesifik yang larut dan terikat membran dalam medium kultur. Keputusan banyak kajian telah menunjukkan bahawa untuk kemandirian dan percambahan sel kuman primer, kehadiran bukan sahaja LIF tetapi juga faktor Keluli terikat membran dan larut (SIF) dalam medium kultur adalah perlu. Peptida ini dihasilkan oleh sel somatik embrio homozigot untuk mutasi Keluli, dan salah satunya ialah ligan proto-onkogen cKit.

Sel-sel kuman primer mamalia dan manusia mempunyai asal ekstragonadal dan merupakan sumber perkembangan klon garis sel kuman. Asal usul garis sel kuman primordial, serta semua tisu embrio dan mesoderm ekstraembrionik, adalah epiblast (ektoderm primer) embrio awal, yang mempunyai organisasi struktur mozek. Menggunakan kaedah penyingkiran mikrosurgikal pelbagai bahagian embrio awal, zon penyetempatan dalam epiblast klon prekursor komited sel kuman primordial telah ditubuhkan. Menggunakan rhodamine dextran, yang digunakan sebagai penanda sel, didapati bahawa prekursor sel kuman primordial disetempat di kawasan proksimal epiblast, berhampiran ektoderm ekstraembrionik. Garis sel kuman primordial timbul daripada klon 45 sel, peruntukannya berlaku pada permulaan gastrulasi. Kemudian klon mengasingkan, dan semasa gastrulasi sel-sel kuman primer memasuki mesoderm ekstraembrionik dan ditemui di pangkal allantois rudiment, di belakang coretan primer. Dari sana sel-sel kuman primer berhijrah ke bahagian ventral endoderm usus belakang dan kemudian bergerak secara aktif di sepanjang mesenterium, mengisi rabung alat kelamin pada penghujung penghijrahan. Semasa penghijrahan, serta dalam 2-3 hari pertama penyetempatan dalam rudimen gonad, sel-sel kuman primer secara aktif membiak dan menjalani lapan kitaran replikatif. Jika pada permulaan penghijrahan terdapat kira-kira 50 sel kuman primer, maka dalam rabung kemaluan embrio tikus selama dua belas hari perkembangan bilangan sel kuman primer melebihi 25,000.

Persamaan fungsi ESC dan sel kuman primordial dibuktikan dengan integrasi lengkap yang terakhir ke dalam blastokista dengan penggantian jisim sel dalaman dan perkembangan penuh embrio seterusnya, tisu yang hanya terdiri daripada keturunan sel kuman primordial. Dalam sifat lain, sel kuman primordial tikus juga ternyata sama dengan ESC, menunjukkan keupayaan untuk membezakan dalam pelbagai arah, untuk membentuk badan embrioid secara in vitro, dan membentuk teratoma dalam vivo apabila diberikan secara subkutan kepada tikus yang kurang imun, menyerupai teratoma testis spontan dalam tikus 129/ter.

Didapati bahawa apabila LIF, SIF terikat membran dan larut ditambahkan pada medium, sel-sel kuman primer terpencil bagi embrio tikus berusia 8 hari bertahan dan membiak dalam kultur selama 4 hari, tetapi kemudian mati. Lebih-lebih lagi, tempoh apabila kematian sel-sel kuman primer diperhatikan dalam kultur bertepatan dengan peringkat perkembangan embrio tikus (12.5-13.5 hari) apabila sel-sel kuman utama wanita memasuki meiosis dalam rudimen gonad, dan pembahagian mitosis disekat dalam sel-sel kuman utama lelaki. Walau bagaimanapun, jika bukan sahaja faktor pertumbuhan LIF dan SIF, tetapi juga FGF2 ditambah kepada medium, sel-sel kuman primer terus membiak, dan koloni sel yang mampu membiak walaupun selepas penyingkiran faktor pertumbuhan (SIF dan FGF) daripada medium terbentuk dalam subkultur. Sel-sel tersebut boleh dibiakkan untuk masa yang lama pada substrat fibroblas embrio tanpa menambah faktor pertumbuhan terlarut LIF. Ia dicadangkan untuk memanggil talian sel stabil yang diperoleh daripada sel kuman primordial sel kuman embrio. Istilah ini tidak berjaya sama sekali, kerana adalah mustahil untuk mendapatkan sel-sel kuman embrio yang mampu melakukan peringkat oogenesis atau spermatogenesis berikutnya apabila mengkultur sel EG. Ini disebabkan oleh fakta bahawa garisan sel EG, walaupun ia berasal dari sel kuman primordial, tetapi, memperoleh sifat sel stem pluripoten embrionik dalam kultur, kehilangan keupayaan untuk berkomitmen kepada keturunan kuman. Dalam erti kata lain, sel kuman primordial, apabila ditanam, kehilangan sifat prekursor gamet dan berubah menjadi sel pluripoten seperti ESC.

Telah diperhatikan bahawa teratoma tidak timbul apabila sel EG dimasukkan ke dalam tikus immunodeficient. Diandaikan bahawa kehilangan keupayaan sel EG manusia untuk menimbulkan teratoma adalah disebabkan oleh fakta bahawa garis-garis ini tidak dicipta secara langsung daripada sel-sel kuman primer yang dikultur, tetapi diperoleh daripada sel-sel yang diasingkan daripada badan embrioid. Oleh itu, ada kemungkinan bahawa mereka adalah keturunan sel pluripoten, tetapi sudah komited.

Perlu diingatkan bahawa terdapat perbezaan asas antara sel EG dan sel germa primordial. Yang terakhir tidak membenarkan mendapatkan embrio tikus chimeric, yang menunjukkan kekurangan keupayaan sel kuman primordial untuk berintegrasi ke dalam jisim sel dalam atau trophectoderm. Ciri-ciri populasi sel kuman primordial lebih serupa dengan garis komited sel somatik embrio kemudian, pengenalannya ke dalam blastokista juga tidak membawa kepada pembentukan embrio chimeric.

Pengubahsuaian teknik pengkulturan badan embrioid yang diperoleh melalui pengagregatan sel EG memungkinkan untuk mendapatkan satu lagi populasi sel pluripoten, yang dipanggil "sel terbitan badan embrio" (sel EBD), menggunakan pemilihan pada media terpilih. Keupayaan sel EBD untuk membiak dalam kultur untuk masa yang lama memungkinkan untuk mencipta garisan sel yang stabil bagi sel komited. Klon sel yang mengekspresikan pelbagai mRNA dan penanda protein sel khusus diperolehi. Pendekatan ini akhirnya membuktikan bahawa sel kuman utama manusia adalah pluripoten dan membezakan secara in vitro kepada jenis sel yang berbeza: neuron, neuroglia, endothelium vaskular, sel hematopoietik, otot dan sel endodermal.

Sumber alternatif sel stem embrionik

Sumber alternatif talian ESC manusia mungkin sel hibrid. Implantasi ke dalam rahim lembu hamil pseudo dari binaan heterogen yang diperolehi melalui gabungan melalui elektroporasi sel somatik janin manusia dengan telur lembu dari mana pronukleus dikeluarkan sebelum ini memungkinkan untuk mendapatkan jisim sel dalaman dari embrio buatan peringkat pra-implantasi pembangunan. Untuk tujuan ini, pada peringkat pertama blastokista diperoleh daripada telur lembu dengan nukleus sel manusia yang dipindahkan.

Pada peringkat kedua, embrioblast diasingkan daripada blastokista, dan daripadanya, ESC diasingkan menggunakan kaedah Thomson. Perlu diperhatikan bahawa keputusan terbaik dalam mengasingkan talian ESC menggunakan kaedah ini diperoleh menggunakan nukleus sel folikel atau sel kuman primer yang kekal dalam tubuh manusia dalam keadaan hibernasi. Ini disebabkan oleh fakta bahawa nukleus sel manusia yang dipindahkan ke dalam telur lembu mesti mempunyai telomer yang tidak dipendekkan dan aktiviti telomease yang tinggi, yang membantu mengelakkan penuaan pramatang klon ESC yang diperoleh daripada telur hibrid (Repin, 2001). Adalah diketahui bahawa protein penanda intraselular ESC yang paling penting ialah Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, yang tergolong dalam protein penyenyap kromatin yang dipanggil. Penyenyap menyediakan pakej heterochromatin yang sangat padat, yang menghalang pembentukan gelung euchromatin. Pembungkusan kromatin yang dimediasi oleh protein ini berkorelasi dengan totipotensi genom ESC. Telah ditubuhkan sehingga kini bahawa lembu matang dan oosit manusia adalah satu-satunya jenis sel khusus yang mengandungi kepekatan tinggi protein penyenyap dalam sitoplasma. Atas dasar ini, kaedah telah dibangunkan untuk mendapatkan ESC hibrid dengan memindahkan nukleus sel somatik ke dalam oosit lembu enukleasi. Kajian in vitro awal telah menunjukkan bahawa sitoplasma oosit lembu mengembalikan totipotensi genom nukleus sel somatik manusia selepas 12-24 jam penanaman.

Kepentingan khusus ialah data tentang keanehan perkembangan praimplantasi embrio manusia, yang menunjukkan penggantian sel totipoten kemudian oleh populasi sel pluripoten berbanding tikus. Kajian tentang transformasi selular menunjukkan bahawa sel trofoblas juga timbul daripada sel jisim sel dalaman blastokista manusia, sebagai tambahan kepada ESC, yang menunjukkan potensi keseluruhannya.

Adalah diketahui bahawa pada peringkat blastokista, dua populasi sel komited yang berbeza timbul. Salah satunya membentuk lapisan luar blastokista - trophectoderm, derivatifnya adalah sel trofoblas dan komponen embrio plasenta yang lain. Populasi kedua sel dikelompokkan ke dalam jisim padat yang menghubungi permukaan dalaman trofektoderm. Derivatif populasi sel jisim sel dalam adalah semua tisu dan asas organ embrio. Pada peringkat blastokista lewat, endoderm ekstraembrionik terbentuk daripada jisim sel dalam dan epiblast (ektoderm primer) terbentuk. Dalam kes ini, sel epiblast mengekalkan pluripotensi, manakala keupayaan untuk membezakan sel endoderm ekstraembrionik adalah terhad.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Mendapatkan sel stem embrio manusia

Sehingga baru-baru ini, dipercayai bahawa adalah mustahil untuk mendapatkan ESC daripada trophoblast. Walau bagaimanapun, barisan sel stem trofektoderm diploid yang diasingkan daripada blastokista membiak dan berubah menjadi sel stem dalam medium yang mengandungi FGF2 dan heparin bukannya LIF. Jika FGF2 dikeluarkan dari medium, sel trofektoderm berhenti membiak, endoreduplikasi kromosom bermula di dalamnya, dan unsur selular trofektoderm secara beransur-ansur berubah menjadi sel trofoblas gergasi. Mungkin, LIF tidak merangsang percambahan sel trophectoderm kerana fakta bahawa FGF2 mencetuskan mekanisme isyarat trans yang berbeza, kerana FGF2, mengikat kepada reseptor plasma (FGFR2), mengaktifkan kinase MAP dalam sitoplasma - ERK1 dan ERK2. Akibatnya, apabila satu laluan isyarat (LIF - gpl30 - JAK kinase - STAT3) dihidupkan dalam sel blastokista, sel-sel jisim sel dalam diubah menjadi ESC pluripoten, dan apabila mekanisme kedua transduksi isyarat transmembran (FGF2 - FGFR2 - MAP kinase ERK1/ERK2 diaktifkan dalam sel stem, ERK1/ERK2) diaktifkan. blastokista. Pilihan laluan isyarat pula bergantung kepada aktiviti gen oct4. Gen ini, yang tergolong dalam domain POU, terletak di lokus t autosom 17 dan dinyatakan semasa oogenesis, semasa tempoh pembelahan, serta dalam sel-sel jisim sel dalaman blastokista dan dalam sel-sel kuman primer. Peranan fungsi gen oct4 adalah untuk menyandikan faktor transkripsi yang diperlukan untuk kemunculan sel pluripoten, pembezaan dan dedifferentiasi mereka.

Ekspresi gen oct4 dalam ESC berbeza-beza bergantung pada interaksi faktor transkripsi ini dengan kofaktor. Peraturan terarah ekspresi oct4 dalam blastocysts menunjukkan bahawa apabila aktivitinya dikurangkan, separuh daripada sel membentuk trophectoderm, manakala apabila ekspresi teraruh oct4 meningkat, kebanyakannya ESC timbul.

Dalam eksperimen, ESC tidak boleh dipindahkan ke dalam satu garisan semasa penanaman blastomer totipoten pada peringkat pembelahan, serta pada peringkat gastrulasi dan peringkat perkembangan embrionik kemudian. ESC tikus biasanya diasingkan pada hari ke-3.5-4.5 kehamilan, yang sepadan dengan peringkat keenam (blastokista lapisan tunggal) dan peringkat ketujuh (blastokista dua lapisan - silinder telur awal) embriogenesis normal. Jelas sekali, hanya dalam tempoh praimplantasi embrio tetikus mengandungi populasi sel yang mampu berubah menjadi ESC. Akibatnya, pengasingan garis ESC hanya mungkin pada peringkat embriogenesis tertentu. Zigot dan blastomer yang timbul semasa pembelahan adalah totipoten, dari sudut pandangan kemungkinan untuk membangunkan embrio yang berdaya maju dengan membran embrio dan plasenta. Kehilangan potensi jumlah sel kuman bermula pada peringkat akhir morula, apabila komitmen selanjutnya blastomer bergantung pada lokasinya. Blasomer morula awal mengekalkan totipotensi, kerana manipulasi eksperimen dengan perubahan dalam penyetempatan mereka, seperti penyongsangan lokasi mereka, tidak menghalang perkembangan embrio sepenuhnya.

Telah ditetapkan bahawa kecekapan mengasingkan ESC ke dalam garis dipengaruhi oleh keadaan blastokista pada masa penjelasannya. Penggunaan blastokista selepas memodelkan diapause tujuh hari dalam saluran pembiakan tikus yang diovariektomi pada hari ke-3.5 kehamilan dan diberikan progesteron memudahkan pengasingan yang lebih berjaya bagi garisan sel stem embrio. Diandaikan bahawa dalam keadaan sedemikian bilangan blastomer yang membentuk jisim sel dalam meningkat. Ia juga mungkin bahawa kitaran sel dipanjangkan dan kebanyakan blastomer memasuki fasa G0.

Di samping itu, penciptaan garis ESC pluripoten yang stabil bergantung pada genotip embrio: ESC agak mudah diasingkan daripada blastokista garisan tikus 129, ia lebih sukar diperoleh menggunakan tikus CS7BL/6, dan hampir mustahil untuk mengasingkan garis ESC daripada blastokista tikus CBA/Ca. Jelas sekali, embrio awal mempunyai beberapa ciri genetik yang mempengaruhi perkembangan garis ESC pluripoten. Walau bagaimanapun, apabila mengkultur epiblas terpencil, serta dengan pemilihan sel pembezaan terpilih, garisan ESC bagaimanapun diasingkan daripada embrio awal tikus CBA/Ca.

Teknik standard yang terbukti untuk mendapatkan talian ESC daripada blastokista diberikan dalam manual makmal mengenai teknik eksperimen dengan embrio awal. Garisan ESC eksperimen juga boleh diperolehi dengan mengkultur epiblas terpencil (ektoderm primer) embrio tikus berusia 4.5 hari menggunakan teknik mikrosurgikal yang agak kompleks dan keadaan kultur yang diubah suai. Keamatan buruh prosedur ini adalah wajar, kerana kekerapan pembentukan garis ESC dalam kes ini ternyata jauh lebih tinggi daripada dalam kerja-kerja dengan jisim sel dalaman blastokista.

Untuk mengasingkan garisan ESC, setiap klon dipindahkan ke microwell, agregat 40-60 sel ditanam, dan kemudian tersebar semula. Pengulangan berbilang prosedur ini membolehkan kami memperoleh garis ESC yang diabadikan dengan kadar percambahan maksimum sel normokaryotypic yang dilekatkan pada plastik, yang mengekalkan totipotensi dan aktiviti telomerase yang tinggi selepas 50-100 laluan. Dalam proses mengekalkan talian ESC, bahaya terbesar ialah pencemaran medium atau serum dengan endotoksin bakteria - malah kepekatan surih endotoksin dalam medium kultur menyebabkan kematian besar-besaran sel kuman yang tidak matang. Dengan pemantauan yang teliti terhadap pertumbuhan linear dan penyebaran tepat pada masanya, ESC dalam kultur mampu membahagikan simetri, di mana kedua-dua sel anak kekal pluripoten dan mampu melakukan bilangan kitaran sel yang tidak terhad, mengekalkan karyotype diploid dan potensi keseluruhan.

Pemilihan populasi tulen ESC manusia boleh dilakukan selepas pemindahan genom mereka dengan molekul DNA rekombinan yang mengandungi gen pengekodan sintesis protein pendarfluor hijau (GFP). Ekspresi GFP meningkat apabila ESC ditanam di bawah keadaan yang menyokong percambahannya, manakala dengan permulaan pembezaan tahap ekspresi gen ini berkurangan, yang membolehkan pemilihan garisan sel pluripoten stabil tulen pada medium terpilih. Apabila mengkultur ESC yang diasingkan menggunakan pemilihan GFP, kekerapan pembentukan koloni meningkat berkali-kali ganda, kerana kesan antiproliferatif yang kuat bagi sel yang dibezakan dihapuskan di bawah keadaan kultur pemilihan.

Terjemahan sel stem embrio manusia ke dalam garisan dijalankan menggunakan kaedah pengasingan mereka daripada embrio praimplantasi (pada peringkat 80-120 sel), yang kekal selepas prosedur persenyawaan in vitro. Untuk tujuan ini, embrio "berlebihan" yang diperoleh secara buatan disebarkan secara mekanikal dalam medium Delbecco-Eagle. Selepas melabelkan sel dengan antibodi monoklonal terpilih dengan label pendarfluor, sel embrioblast diasingkan. Embrioblast disebarkan ke dalam sel individu menggunakan campuran dispase-kolagenase. Sel-sel tercerai ditanam dalam medium khas (80% medium Delbecco + 20% serum anak lembu janin dengan kehadiran 500 μg/ml IL-6, LIF dan SCF) di atas satu lapisan penyuap fibroblas embrio pada 3 laluan pertama. Dalam kes ini, kemandirian dan percambahan sel stem dan progenitor dikekalkan kerana kesan IL-6, LIF dan SCF. Dalam medium sedemikian, ESC tumbuh sebagai klon penggantungan sel bebola yang tidak terikat, yang mesti dipisahkan dengan pemipetan yang lembut dan berulang. Klon baharu muncul dalam budaya yang digantung pada hari ke-5-7. Kadar pertumbuhan maksimum ESC dicapai dengan pemisahan berulang klon pada peringkat 10-15 sel. Kemudian, setiap klon dipindahkan ke microwell dan ditanam kepada agregat 40-50 sel. Prosedur ini diulang berkali-kali dalam petikan, meningkatkan jumlah kultur kepada ketumpatan 5-10 juta sel setiap hidangan 6-cm. Menggunakan laluan sedemikian, Thomson mengasingkan 10 klon abadi ESC manusia, yang selepas 100 petikan mengekalkan aktiviti telomerase yang tinggi, keupayaan untuk membiak dengan cergas, ciri-ciri fenotip yang minimum, dan potensi penuh dengan keupayaan untuk membezakan kepada mana-mana 350 garisan sel khusus yang diperoleh daripada ecto-, meso-, dan endoderm. Pembezaan ESC manusia bermula (selepas perubahan sederhana, penambahan serum, dan penghapusan LIF) dengan lampiran sel pada substrat, menunjukkan perkembangan sitoskeleton dan ekspresi reseptor lekatan. Yang penting, dengan percambahan tanpa had, ESC manusia mengekalkan karyotype normal.

Kaedah kedua mengasingkan garisan ESC manusia adalah berdasarkan penggunaan sel kuman primer. Kajian eksperimen menunjukkan bahawa garisan sel E boleh diperolehi daripada lipatan kemaluan embrio tikus berusia 12.5 hari. Walau bagaimanapun, dalam kes ini kekerapan pembentukan garisan sel progenitor adalah jauh lebih rendah daripada eksperimen dengan embrio terdahulu. Pada masa yang sama, sel-sel kuman primer daripada gonad embrio tikus 13.5 hari usia kandungan tidak mampu untuk berubah menjadi garisan sama sekali.

Garisan stabil pertama sel EG manusia pluripoten diperoleh daripada gonosit primer yang diasingkan daripada gonad embrio berusia 5-9 minggu. Sel-sel terpencil telah dibiakkan pada substrat fibroblas embrio tetikus yang tidak aktif dalam medium DMEM dengan serum janin ditambah dengan mercaptoethanol, forskolin, dan faktor pertumbuhan manusia rekombinan (FGF dan LIF). Selepas 7-12 hari, koloni multiselular muncul dalam budaya, sepadan dengan sel EG manusia dengan ciri morfologi dan penanda molekul. Selepas pengagregatan, sel-sel ini membentuk badan embrioid, dengan perkembangan selanjutnya yang mana sel-sel khusus ciri-ciri derivatif ketiga-tiga lapisan kuman muncul. Sepanjang 10-20 laluan, garisan sel EG mengekalkan karyotype normal dan tidak kehilangan pluripotensi.

Ia juga telah ditunjukkan bahawa tindakan gabungan LIF, faktor Keluli terikat membran dan larut, dan TGF-b mengubah program pembangunan sel kuman primordial. Daripada menghentikan pembahagian mitosis dan mula membezakan ke arah oogenesis atau spermatogenesis, sel kuman primordial terus membiak. Selepas beberapa kitaran mitosis tambahan, ia menjadi serupa dengan sel epiblast dan, kehilangan sifat prekursor sel kuman, diubah menjadi sel EG stem embrionik pluripoten.

Oleh itu, pada tahun 1998, garisan sel kuman primordial yang diabadikan untuk pertama kalinya diasingkan daripada asas kemaluan tisu autopsi janin manusia. Dalam embriogenesis manusia, sel-sel kuman primordial muncul dalam kantung kuning telur pada minggu ke-3 perkembangan, dan pada minggu ke-4-5, sel-sel ini berhijrah ke zon tuberkel genital, di mana ia membentuk populasi tidak aktif gonosit primer. Dalam keadaan tidak aktif, sel kuman primordial dipelihara dalam embrio sehingga kelahiran. Garisan sel kuman primordial diasingkan daripada tuberkel kemaluan janin embrio 5-9 minggu, tisu yang diekstrak adalah ex tempore dirawat dengan campuran kolagenase jenis IV-V, hyaluronidase dan DNase untuk meningkatkan hasil kuantitatif dan kualitatif sel. Sel germa primordial dalam tisu tuberkel alat kelamin janin dikelilingi oleh sel Sertoli stromal (mesenchymal). Tujuan fungsi sel Sertoli adalah untuk menghasilkan faktor antiapoptosis (ligan Fas), mitogen, dan imunosupresan yang melindungi sel kuman daripada serangan imun oleh badan. Di samping itu, persekitaran mikro stromal tuberkel genital memainkan peranan penting dalam kematangan gamet. Sel-sel kuman primer yang terpencil ditanam dalam kultur di atas lapisan stromal penyuap yang terdiri daripada fibroblas janin daripada tiga laluan pertama. Gabungan mitogen yang paling berkesan ialah kompleks yang terdiri daripada LIF, FGF, dan forskolin (perangsang pembentukan cAMP). Percambahan sel kuman primer secara in vitro memerlukan penambahan serum janin, dengan kehadirannya pembiakan gonosit primer dalam budaya disertai dengan pembentukan klon sel sfera yang tidak dilekatkan pada substrat.

Di Institut Kesihatan Nasional, Amerika Syarikat, berdasarkan ringkasan data sedia ada tentang kaedah untuk mengasingkan garisan ESC manusia daripada blastokista, kesimpulan awal telah dibuat bahawa pengasingan ESC yang berjaya berkemungkinan besar apabila mengkultur blastokista dengan jisim sel dalam yang terbentuk dengan baik (Sel stem: kemajuan saintifik dan arahan penyelidikan masa depan Kesihatan USA). Dari sudut pandangan ini, sumber ESC yang optimum untuk mencipta garis adalah blastokista manusia pada hari ke-5 perkembangan, dari mana trofektoderm harus dikeluarkan dengan berhati-hati apabila mengasingkan jisim sel dalam. Jisim sel dalam yang terpencil, yang terdiri daripada 30-35 sel pada peringkat ini, harus dibiakkan pada substrat fibroblas tikus embrio, yang merupakan syarat penentu untuk pembentukan koloni ESC dalam kultur.

Analisis ciri fenotip sel stem embrio

Kepentingan khusus ialah analisis perbandingan interspesies bagi ciri fenotip ESC. Telah didapati bahawa koloni ESC manusia adalah gugusan padat sel-sel seperti epitelium yang rata, manakala badan embrioid tikus terdiri daripada konglomerat longgar sel bulat. Dalam ESC manusia, indeks nisbah nuklear-plasma lebih rendah daripada ESC tetikus. Sel stem embrio monyet membentuk koloni sel yang lebih rata dengan tepi yang tidak rata. Sel individu mudah dilihat dalam klon awal ESC primat. ESC yang membiak semua spesies haiwan yang dikaji tidak menyatakan molekul MHC kelas I dan II. Pada masa yang sama, ESC manusia memberikan reaksi positif terhadap antibodi TERA 1-60 dan GCTM-2, yang menunjukkan kehadiran proteoglycans keratin/chondroitin sulfate pada permukaannya, ciri sel stem embrio-(terato)-karsinoma. Ekspresi gen oct4 dalam ESC semua spesies haiwan menunjukkan bahawa, walaupun terdapat perbezaan fenotip, set gen yang sama yang bertanggungjawab untuk mengekalkan pluripotensi nampaknya diaktifkan dalam ESC manusia dan tikus (Peru, 2001). Di samping itu, garisan ESC yang diasingkan daripada embrio tikus, babi, arnab, primata dan lembu mempunyai ciri morfologi yang sama, satu set penanda pengenalan molekul yang serupa dan mekanisme molekul yang hampir sama untuk melaksanakan program embriogenesis, yang membolehkan kita melihat baru pada masalah xenotransplantasi.

Tidak seperti embriogenesis biasa dalam vivo, percambahan ESC secara in vitro tidak disertai dengan pembentukan lapisan kuman dan berlaku dengan latar belakang penyekatan Hoxgenes homeotik, iaitu, tanpa organogenesis. Oleh kerana gen segmentasi tidak berfungsi, adalah mustahil untuk menghasilkan semula tempoh embriogenesis seperti peletakan somit, segmentasi embrio, pembentukan kantung kuning telur, allantois dan organ dan tisu sementara lain dalam kultur ESC. ESC yang dikultur nampaknya telah membeku pada permulaan proses pembentukan 350 garis sekatan sel khusus. Oleh itu, klon sel progenitor anak perempuan dan ESC setempat terpusat mewakili hanya model embrio, semasa pembangunan garisan sel khusus yang berbeza secara serentak terbentuk di kawasan tisu yang berbeza, yang, bagaimanapun, berasal dari prekursor biasa. Walaupun tahap minimum reseptor pada permukaan ESC, mereka mengekalkan keupayaan untuk menjalankan proses morfogenetik primitif, meniru struktur volumetrik embrio awal: penggantungan ESC dalam agregat kultur dan membentuk struktur yang menyerupai blastokista atau embrio yang lebih baru (silinder telur). Agregat ampaian sedemikian masing-masing dipanggil badan embrioid ringkas dan kompleks.

Dalam pembezaan campuran, gen awal ektoderm (oct3, fgf-5, nodal), endoderm (gata-4), mesoderm (brachyury), mesoderm kardiogenik (pkh-2.5), tiub neural (msx3) dan hematopoiesis (elkf) diekspresikan secara serentak dalam sel-sel badan yang berbeza bagi satu embrioid. Menggunakan pelbagai kombinasi faktor pertumbuhan dan sitokin untuk tindakan yang disasarkan pada pembentukan sel lapisan kuman secara in vitro, adalah mungkin dalam beberapa kes untuk mendapatkan badan embrioid di mana gen ektoderm atau mesoderm lebih disukai dinyatakan, yang membuka jalan untuk memodelkan gastrulasi dan fasa awal organogenesis.

Pertumbuhan klon ESC adalah bukti pembahagian sel asimetri, di mana hanya satu ESC di tengah klon mengekalkan potensi percambahan tanpa had, manakala sel anak kedua menjana generasi sel progenitor yang sudah mengalami pembezaan. Oleh itu, kadar percambahan klon di pinggir badan embrioid adalah lebih tinggi daripada di tengah. Sel-sel marginal klon yang semakin meningkat mengalami pembezaan bercelaru spontan, berhijrah, atau mati oleh mekanisme apoptosis. Peristiwa ini menentukan nasib klon: jika kadar percambahan melebihi kadar penghijrahan dan kematian sel apoptosis, saiz klon terus meningkat, penstabilan berlaku apabila kadar apoptosis dan kadar pembentukan sel baru adalah sama, dan regresi berlaku apabila nisbah proses ini adalah songsang. Sel-sel progenitor membahagi secara simetri, iaitu, kedua-dua sel anak kemudiannya membezakan kepada garisan sel khusus yang matang. Nisbah ESC kepada sel progenitor berbeza-beza, tetapi bilangan ESC sentiasa hanya sebahagian kecil daripada peratus populasi sel progenitor. Oleh itu, hanya paip yang berhati-hati dan pengasingan klon tepat pada masanya boleh meningkatkan bilangan ESC dalam budaya. Pengasingan klon pada peringkat 10-12 sel ternyata paling berkesan untuk mendapatkan hasil maksimum ESC. Arah dan tahap pembezaan sel dalam badan embrioid bergantung pada lokasinya. Sel-sel luar badan embrio tidak mengekspresikan gen oct4 dan menjalani pembezaan ke dalam sel-sel endoderm primer, dari mana sel-sel seperti epitelium endoderm ekstraembrionik parietal dan viseral terbentuk. Sel-sel dalaman badan embrioid mengekspresikan gen oct4 dan mengekalkan pluripotensi selama 48 jam penanaman. Walau bagaimanapun, budaya itu kemudiannya disusun semula secara morfologi menjadi satu lapisan epitelium dan ekspresi gen yang mengawal perkembangan ektoderm primer bermula. Seterusnya, proses pembezaan sitod bercelaru total bermula dengan penampilan pelbagai jenis sel yang merupakan terbitan daripada ketiga-tiga lapisan kuman. Dalam proses pembezaan spontan sel-sel badan embrio, agregat dengan penanda endoderm dalam bentuk serpihan (sista) kantung kuning telur adalah yang pertama muncul. Kemudian, angioblast dan sel endothelial kapilari yang semakin meningkat muncul dalam struktur ini. Pada peringkat akhir pembezaan spontan, pelbagai sel yang dibezakan secara terminal berkembang daripada sel dalaman badan embrioid, termasuk neuron, unsur glial, kardiomiosit, makrofaj, dan eritrosit. Pada tahap tertentu (dengan mengambil kira penyongsangan spatial pembentukan lapisan tisu germinal), menggunakan badan embrioid, adalah mungkin untuk mengkaji proses morfogenetik secara in vitro dan menganalisis mekanisme molekul tempoh awal pembezaan sitodonik embrio,serta untuk mewujudkan peranan gen tertentu dalam pelaksanaan proses ini.

Oleh itu, dalam klon terdapat sel di mana program pembangunan genetik yang berbeza telah ditemui - ESC, nenek moyang awal dan populasi progenitor yang membezakan. Penanaman ESC dengan kaedah titisan gantung atau kultur massa tanpa lapisan penyuap dan tanpa menambah LIF ke medium tidak dapat tidak membawa kepada pembentukan badan embrioid. Morfologi sel-sel lapisan luar dan dalam badan embrioid berbeza. Lapisan luar terdiri daripada sel-sel yang besar dan bercabang. Permukaan mereka yang menghadap ke persekitaran ditutupi dengan banyak mikrovili. Lapisan luar sel dipisahkan dari lapisan dalam oleh membran basal yang menyerupai membran Reichert, manakala sel-sel lapisan dalam badan embrioid adalah epitelium kolumnar. Secara morfologi, lapisan dalam, walaupun ia mengandungi banyak sel pembahagi, lebih hampir menyerupai koloni ESC yang tidak dibezakan.

Ciri-ciri sel stem embrio manusia

Ketiadaan interaksi isyarat parenchymatous-mesenchymal terhadap latar belakang penyekatan gen homeosis membawa kepada pertumbuhan ESC yang tidak teratur dalam budaya, kerana ini mengganggu pembentukan dan pembangunan infrastruktur organ sementara. Pertumbuhan yang tidak teratur dan pembezaan spontan ESC yang tidak teratur dalam kultur adalah disebabkan oleh ketiadaan tanda mesenchymal pada rangka stromal organ masa depan: secara in vitro, adalah mustahil untuk membentuk berjuta-juta hepatosit, tetapi adalah mustahil untuk mendapatkan lobul hati tunggal yang merangkumi unsur-unsur struktur dan berfungsi seperti sinus, ruang Disse, dan Kupffer.

Adalah dipercayai bahawa pluripotensi ESC direalisasikan secara eksklusif dalam embriogenesis dengan pembentukan tisu dan organ embrio, manakala plasenta dan tali pusat adalah derivatif trofoblas. ESC yang tertutup dalam membran trophectodermal secara berurutan menjana klon sel sementara yang melaksanakan program pembangunan melalui mRNA gabungan matriks topografi volumetrik Nokhteyov, yang menentukan terlebih dahulu susunan ruang, bentuk dan saiz, bilangan sel organ sementara dan muktamad, serta pemasangan unit struktur dan fungsian ke dalam parenchyma. Pada masa yang sama, ESC kekal sebagai satu-satunya jenis sel di mana mekanisme molekul untuk pelaksanaan potensi mereka terputus sepenuhnya daripada program pembangunan genetik, dan ESC sendiri kehilangan keupayaan untuk berinteraksi dengan sel lain disebabkan oleh penyekatan kedua-dua persepsi reseptor dan sistem transsignaling. Walau bagaimanapun, pengaktifan ESC yang mencukupi membawa kepada pembangunan langkah demi langkah program embriogenesis, berakhir dengan kelahiran organisma yang terbentuk sepenuhnya, yang terdiri daripada berbilion sel, bersedia untuk kehidupan luar rahim. Pada laluan jangka pendek tetapi jangka panjang yang tidak dapat dibayangkan dalam ruang selular ini, ralat tidak dapat dielakkan timbul dalam kedua-dua mekanisme molekul yang memastikan aktiviti penting sel dan dalam program yang mengawal percambahan, pembezaan dan pengkhususan mereka. Oleh itu, dalam farmakogenomik moden, penyakit struktur molekul dan penyakit pengaturcaraan sel dianggap secara berasingan. Selain itu, tindakan kebanyakan ubat baru bertujuan untuk membetulkan program pembezaan, percambahan dan organogenesis, serta penjanaan semula organ dan tisu. Dalam organisma dewasa, ESC memungkinkan untuk mengawal tingkah laku sel stem/progenitor yang dipindahkan ke dalam otak, hati, limpa, sumsum tulang dan organ manusia lain untuk memulihkan parenkim organ penerima yang rosak dengan membezakan dan mengkhususkan sel penderma pada matriks mesenchymal yang dipelihara. Pada dasarnya, program totipotensi mula direalisasikan pada tahap genom oosit, zigot, dan blastomer; walau bagaimanapun, sel-sel ini belum lagi diklon dan disalurkan dalam kuantiti yang diperlukan untuk keperluan perubatan eksperimen dan praktikal. Oleh itu, ESC kekal sebagai sumber unik maklumat genetik yang mengandungi kod untuk peta tiga dimensi embrio dan kod untuk sekatan linear garisan sel khusus semasa gastrulasi.

Potensi regeneratif ESC yang hampir tidak terhad adalah disebabkan oleh fakta bahawa genom mereka, tidak seperti alat genetik sel somatik yang dibezakan, mengekalkan pluripotensi. Salah satu manifestasi keadaan tidak aktif maklumat genetik yang tertanam dalam ESC ialah fenotip minimum yang dipanggil - bilangan reseptor yang terhad dinyatakan pada permukaan ESC, dan, dengan itu, sangat sedikit program isyarat trans yang digunakan untuk interaksi alat nuklear sel dengan persekitaran mikronya. Dengan latar belakang hibernasi gen yang bertanggungjawab untuk menyekat garisan sel khusus dan pembezaan sel, hanya kira-kira 30 daripada 500 gen diaktifkan, produk yang memastikan sambungan sel dengan persekitaran mikro sekitarnya. Menggunakan kaedah analisis bersiri ekspresi gen, ditunjukkan bahawa dengan kerja biasa kotak fungsi utama genom yang mengawal energetik dan metabolisme dalam sel somatik dan ESC, yang kedua mempunyai tahap mRNA reseptor yang sangat rendah, protein G, utusan sekunder, transkripase, kofaktor ekspresi dan penindasan, iaitu, keseluruhan sistem penghantaran isyarat transmembrane. Ini disebabkan oleh ketiadaan atau ekspresi gen transsignaling yang sangat rendah. Semasa tempoh pembezaan teraruh dalam genom ESC, 18 gen yang berfungsi secara serentak berhenti bekerja dengan latar belakang pengaktifan 61 gen transsignaling yang mengawal sintesis reseptor lekatan sel, komponen matriks ekstraselular, transkripase sekatan dan unsur-unsur penghantar sistem penghantaran isyarat ke membran sel nuklear. Pada masa yang sama, ekspresi gen yang bertanggungjawab untuk sintesis protein penyenyap disekat, serta perencatan bersama ekspresi gen yang memastikan totipotensi genom ESC.

Penanda gen telah ditemui untuk sel ketiga-tiga lapisan kuman. Pengenalpastian lapisan sel ektodermal dilakukan dengan ekspresi gen nodal, oct3 dan fgf-5, sel mesoderm - oleh brachyury, gen zeta-globin, endoderm - oleh ekspresi gen gata-4. Dalam embriogenesis normal semasa tempoh gastrulasi, penghijrahan aktif populasi belum matang sel stem dan progenitor diperhatikan, secara tempatan menandakan zon perkembangan tulang muka tengkorak, beberapa bahagian otak, sistem saraf periferal, sistem pengaliran jantung dan timus, tisu yang terbentuk daripada klon sel migran. Penandaan sel oleh gen awal lapisan kuman memudahkan tugas analisis topografi proses penghijrahan sel prekursor dalam embrio yang sedang berkembang. Telah ditetapkan, khususnya, bahawa dalam agregat sel embriokarsinoma P19, ekspresi brachyury gen mesoderm pertama bermula semasa tempoh penurunan ekspresi gen pengaktif plasminogen tisu, a-fetoprotein, keratin 8 dan keratin 19, yang merupakan penanda populasi mesoderm pertama yang berhijrah. Akibatnya, pembentukan tisu asal mesodermal bermula hanya selepas selesai proses penghijrahan titik dan penyebaran sel progenitor mesodermal.

Walaupun ciri fenotip yang sangat terhad dan ketiadaan kebanyakan unit isyarat trans, ESC masih menyatakan beberapa molekul reseptor yang boleh digunakan untuk pengenalannya. Perlu diperhatikan bahawa antigen penanda ESC pada manusia dan primata ternyata biasa. Selalunya, antibodi berlabel kepada antigen terikat membran SSEA-3, SSEA-4 (antigen lipid unik yang mewakili kompleks glikolipid GL7 dengan asid sialik), serta glikoprotein polimer tinggi TRA-1-81, TRA-1-60 digunakan untuk pelabelan ESC. Di samping itu, ESC menyatakan antigen embrio spesifik SSEA-1 dan fosfatase alkali endogen, serta faktor transkripsi spesifik Oct4. Yang terakhir ini diperlukan untuk mengekalkan mekanisme percambahan ESC - faktor transkripsi khusus Oct4 mengaktifkan ekspresi gen faktor pertumbuhan fibroblast 4 dan menstabilkan ekspresi kotak gen yang bertanggungjawab untuk replikasi DNA tanpa had dalam sel yang tidak matang. Protein penanda intraselular yang paling penting ialah Oct3, Oct4, Tcf dan Groucho, yang berkaitan dengan protein penyenyap kromatin.

Hampir sejurus selepas bertahun-tahun percubaan untuk memupuk ESC di luar badan berjaya dan kultur pertama sel stem yang diasingkan daripada blastokista tikus dan kultur sel kuman primer diperolehi, satu peringkat penyelidikan mengenai potensi pluripoten ESC bermula apabila ia diperkenalkan ke dalam embrio pada peringkat awal perkembangan. Telah ditunjukkan bahawa pada peringkat morula dan blastokista, ESC mampu membentuk embrio chimeric di mana keturunan ESC penderma dikesan dalam semua tisu somatik dan juga dalam gamet. Oleh itu, dalam biologi perkembangan, menggunakan ESC, "jambatan" telah ditubuhkan antara kajian eksperimen in vivo dan in vitro, yang secara signifikan memperluaskan kemungkinan untuk mengkaji proses meletakkan tisu dan organ utama, pembezaan dan organogenesis embrio.

Telah jelas bahawa in vivo semasa embriogenesis ESC disepadukan ke dalam jisim sel embrio awal, dan derivatifnya terdapat dalam semua organ dan tisu. ESC menjajah barisan sel kuman dalam embrio chimeric, yang mana keturunannya membentuk telur dan sperma yang lengkap. Sel stem embrio adalah klonogenik - satu ESC mampu mencipta koloni sel yang serupa secara genetik dengan penanda molekul, yang termasuk ekspresi gen oct4 dan fosfatase alkali, aktiviti telomerase tinggi dan ekspresi antigen embrio tertentu.

Untuk mengkaji mekanisme embriogenesis menggunakan ESC, kaedah chimerization morula telah dibangunkan dengan mencipta konstruk biologi, di luarnya terdapat lapisan blastomer tetraploid penerima, dan ESC penderma diperkenalkan di dalamnya. Oleh itu, trofoblas terbentuk daripada keturunan blastomer tetraploid penerima, yang memastikan implantasi dan plasentasi, dan ESC penderma bertindak sebagai jisim sel dalaman dari mana badan embrio yang berdaya maju dan garisan sel kuman progenitor primer terbentuk. Nilai penyelidikan ESC bukan sahaja terletak pada fakta bahawa pluripotensi dipelihara semasa manipulasi in vitro dengan genomnya, tetapi juga pada hakikat bahawa keupayaan ESC untuk mengambil bahagian dalam pembentukan sel-sel kuman primer embrio chimeric dipelihara. Telah ditunjukkan bahawa keturunan hanya satu ESC yang diubah suai secara genetik mengisi semua asas utama dan membina tisu embrio chimeric yang diperoleh melalui pengagregatan atau penanaman bersama sel ini dengan embrio 8 sel. Apabila ESC yang ditransfeksi dengan gen protein pendarfluor hijau dipindahkan ke dalam morula tikus, keturunan pendarfluor sel ini ditemui dalam semua tisu yang dikaji bagi embrio yang sedang berkembang (Shimada, 1999). Pemindahan ESC ke dalam morula membolehkan penciptaan tikus berdaya maju yang organismanya hanya terdiri daripada keturunan ESC penderma, yang membuka prospek untuk pelbagai pilihan untuk pengklonan terapeutik. Pendekatan metodologi ini kini berjaya digunakan untuk mengkaji masalah biologi perkembangan, khususnya, ia digunakan untuk menganalisis mekanisme ketidakaktifan genetik kromosom X atau ketidakstabilan epigenetik ESC. Pemindahan ESC ke dalam embrio awal juga digunakan dalam bioteknologi pertanian, serta dalam eksperimen terapi gen.

Pemindahan ESC yang diubah suai secara genetik digunakan untuk menguji sel sasaran gen mutan. ESC kultur in vitro digunakan dalam bioteknologi untuk mencipta tikus kalah mati. Untuk tujuan ini, gen yang akan dikaji dikeluarkan daripada ESC dengan penggabungan semula homolog (kalah mati) dan sel yang tidak mempunyai gen ini diasingkan pada media terpilih. Knockout ESC kemudiannya dimasukkan ke dalam blastokista atau diagregatkan dengan blastomer morula. Embrio awal chimeric yang diperoleh dengan cara ini dipindahkan ke dalam betina penerima, dan individu dengan gamet nullizygous untuk gen tertentu dipilih daripada kalangan tikus yang baru lahir. Teknologi ini telah digunakan untuk mencipta banyak barisan tikus kalah mati, yang digunakan secara meluas dalam biologi eksperimen dan perubatan eksperimen. Model biologi sedemikian digunakan untuk mengkaji kepentingan gen tertentu dalam perkembangan embrio, serta peranannya dalam mekanisme penyakit manusia dan keadaan patologi. Di samping itu, garisan haiwan kalah mati digunakan dalam ujian praklinikal kaedah terapi gen baru. Sebagai contoh, dengan memindahkan alel normal gen mutan ke dalam genom ESC, adalah mungkin untuk membetulkan mutasi yang menjejaskan sistem hematopoietik dengan berkesan. Pengenalan gen asing ke dalam ESC membolehkan penciptaan pantas barisan haiwan makmal transgenik homozigot. Walau bagaimanapun, perlu diingatkan bahawa teknik penghapusan gen rekombinasi yang disasarkan setakat ini hanya dibangunkan dengan pasti berhubung dengan ESC tetikus. Menggunakan ESC tetikus kalah mati berganda, peranan fungsi kawasan kluster gen pada kromosom 7 (salinan rantau genomik pada kromosom manusia 19) dan kawasan proksimal kromosom 11 (salinan kromosom manusia 5g) telah ditubuhkan - pemadaman gen ini dalam ESC tetikus membolehkan untuk menilai fungsi analognya dalam manusia.

Kemungkinan mengkaji fungsi gen embriogenesis manusia telah berkembang, pemindahan yang ke dalam genom ESC haiwan makmal telah memungkinkan, khususnya, untuk menjelaskan peranan gen crypto dalam pembentukan dan perkembangan mesoderm kardiogenik, gen pax-6 - dalam embriogenesis mata. Peta pertama ekspresi gen dalam ESC teratokarsinoma dan blastokista tikus yang tidak matang sedang disusun, dan penindasan menindas gen transsignaling dalam ESC telah disahkan. Gabungan 60-80 ESC mutan dan 20-30 sel embrio tikus praimplantasi biasa membawa kepada perkembangan embrio chimeric di mana organ primordia terdiri daripada sel penderma dan penerima, yang memungkinkan untuk menjelaskan peranan gen yang tidak diketahui dalam gastrulasi dan organogenesis. Peta fungsi gen pembentukan embrio tikus telah ditambah dengan maklumat tentang peranan gen sf-1 dalam pembentukan kelenjar adrenal dan gonad, gen wt-1 dalam pembentukan buah pinggang, gen keluarga myoD dalam pembentukan otot rangka, dan gen keluarga gata-1-4 dalam pematangan sekatan limfopoiesis dan ery.opoesis ery.

Diarahkan mematikan alel ibu dan bapa gen dalam ESC menggunakan rekombinasi vektor dibenarkan untuk menjelaskan fungsi pelbagai gen dalam tempoh awal embriogenesis, dan teknologi pemindahan terarah gen manusia yang tidak diketahui ke dalam ESC tetikus menyumbang kepada penemuan gen mutan baru yang bertanggungjawab untuk perkembangan patologi keturunan yang teruk. Menggunakan kaedah kalah mati, kepentingan wajib beberapa gen untuk pembentukan tisu embrio telah ditentukan: gata-4 - untuk miokardium, gata-1 - untuk garis keturunan erythroid tisu hematopoietik, myoD - untuk otot rangka, brachyury - untuk mesoderm, sekatan transkriptases hn2 dan sel-sel hati - ragf3 - untuk sel-sel raksa. pembentukan klon T- dan B-limfosit (Repin, 2001). Pemadaman dua kali gen dalam ESC telah membuka akses kepada kajian peranan fungsi gen lapisan kuman, segmentasi dan homeosis, dan pemindahan ESC telah memungkinkan untuk mendapatkan embrio hibrid interspesies yang berdaya maju. Menggunakan teknik yang dipertingkatkan untuk memindahkan ESC penderma tunggal ke dalam embrio 8 sel, fakta chimerisasi pada tahap selular banyak organ embrio penerima telah terbukti. Perlu diingatkan bahawa pucuk sel tisu manusia telah ditemui dalam organ tikus penerima selepas pengenalan sel stem hematopoietik manusia ke dalam blastokista. Telah ditetapkan bahawa ESC pluripotent beredar dalam darah embrio tikus semasa tempoh pembentukan organ. Ada kemungkinan bahawa fungsi biologi mereka terletak pada organisasi embrio sistem imun masa depan. Dengan bantuan ESC, model patologi genetik manusia yang mencukupi telah dihasilkan semula dalam keadaan makmal: kalah mati dua kali model gen dystrophin Duchenne distrofi otot pada tikus, dan penutupan gen atm (kawalan sintesis kinase isyarat kromatin) - ataxia-telangectasia. Dalam penyakit keturunan yang membawa maut pada kanak-kanak ini, degenerasi sel Purkinje dalam cerebellum berkembang disebabkan oleh kecacatan dalam pembaikan DNA, yang disertai dengan involusi timus akibat kematian sel yang membiak. Gambar klinikal, patofisiologi dan patomorfologi ataxia-telangectasia, dihasilkan semula dengan memperkenalkan maklumat genetik patologi ke dalam ESC, dalam tikus chimera sesuai dengan yang terdapat pada manusia. Sebagai tambahan kepada ataxia-telangectasia, menggunakan ESC dan tikus kalah mati, model eksperimen beberapa penyakit manusia homozigot keturunan yang berkaitan dengan patologi metabolisme karbohidrat dan lipid, katabolisme asid amino, dan perkumuhan kuprum dan bilirubin telah dibangunkan, yang telah mengembangkan dengan ketara keupayaan ubat eksperimen pada peringkat ujian praklinikal manusia yang berkaitan dengan penyakit baru.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

Penggunaan cytohybrids sel stem

Sel hibrid yang diperoleh dengan menggabungkan ESC dengan sel somatik adalah model yang mencukupi dan menjanjikan untuk mengkaji pluripotensi sel stem dan memprogram semula kromosom sel yang dibezakan. Cytohybrids yang diperolehi dengan menggabungkan ESC dengan sel-sel yang dibezakan dari haiwan dewasa memungkinkan untuk mengkaji hubungan antara genom "umur" yang berbeza: situasi unik timbul apabila kromosom homolog yang berasal dari sel pada peringkat pembezaan yang berbeza dan darjah kematangan yang berbeza terletak dalam nukleus yang sama, di mana mereka boleh menukar isyarat pengawalseliaan trans-acting dengan mudah. Sukar untuk meramalkan bagaimana sistem epigenetik cisregulatory kromosom homolog, yang terbentuk semasa pembangunan individu, akan bertindak balas terhadap pengaruh isyarat trans-acting yang terpancar daripada genom berkaitan embrio. Di samping itu, pengasingan kromosom ibu bapa berlaku dalam sel hibrid, yang membolehkan kita mengkaji interaksi genom pada tahap kromosom individu, iaitu, berpotensi untuk mengenal pasti penyertaan kromosom tertentu dalam mengekalkan pluripotensi atau, sebaliknya, jalan keluar kepada pembezaan.

Cytohybrids yang diperolehi dengan menggabungkan teratokarsinoma pluripotent dan sel somatik yang dibezakan telah digunakan sebagai model eksperimen pertama untuk mengkaji interaksi genom dengan "sejarah perkembangan" yang berbeza. Dalam sesetengah kes, sel hibrid tersebut mengekalkan sifat pluripoten pada tahap yang agak tinggi. Khususnya, sel hibrid somatik teratokarsinoma in vivo mendorong perkembangan teratoma sebenar yang mengandungi derivatif ketiga-tiga lapisan kuman, dan in vitro dalam kultur ampaian ia membentuk badan embrioid. Walaupun dalam cytohybrids interspecific jenis ini, kehadiran antigen embrio telah diperhatikan dalam kes di mana rakan kongsi somatik dalam gabungan dengan sel teratokarsinoma adalah limfosit atau timosit. Perlu diperhatikan bahawa cytohybrids dicipta dengan menggabungkan sel teratokarsinoma dengan fibroblas sepadan dengan fibroblas dalam fenotip.

Fakta yang paling penting ialah dalam sel hibrid teratokarsinoma-somatik, tanda-tanda pemrograman semula genom sel yang dibezakan muncul, yang dicirikan oleh pengaktifan semula sama ada gen individu atau kromosom X tidak aktif pasangan somatik. Oleh itu, hasil kajian mengenai cytohybrids jenis sel teratokarsinoma-somatik menunjukkan bahawa pluripotensi sering dipelihara dalam sel hibrid dan terdapat tanda-tanda pemrograman semula genom pasangan somatik.

Dalam eksperimen untuk mendapatkan sel hibrid embrionik intraspesifik dengan menggabungkan ESC tetikus dengan splenosit dewasa, ciri-ciri cytohybrids tersebut telah dikaji, pengasingan kromosom ibu bapa dianalisis, dan pluripotensi genom hibrid telah dinilai. Sel hibrid intraspesifik yang diperoleh dengan menggabungkan sel teratokarsinoma dengan sel somatik biasanya dicirikan oleh tahap pengasingan kromosom yang rendah dengan karyotype tetraploid atau hampir tetraploid. Komposisi kromosom yang serupa diperhatikan dalam cytohybrids semasa penggabungan sel kuman primer dengan limfosit. Pada masa yang sama, sel hibrid interspesifik yang diperoleh dengan menggabungkan sel teratokarsinoma tetikus dengan limfosit cerpelai menunjukkan pengasingan sengit kromosom pasangan somatik.

Tahap kualitatif baru dalam kajian pengasingan kromosom ibu bapa dalam hibrid intraspesifik bermula selepas pembangunan kaedah untuk menganalisis mikrosatelit menggunakan tindak balas rantai polimerase, berkat beberapa ratus penanda ditemui untuk setiap kromosom tetikus, membenarkan diskriminasi yang boleh dipercayai bagi mana-mana pasangan kromosom homolog dalam sel hibrid.

Dengan menggabungkan ESCs (sel HM-1 yang kekurangan aktiviti hypoxanthine phosphoribosyltransferase, 2n = 40, XY, diasingkan daripada blastokista tikus 129/01a) dengan splenosit tikus DD/c konggenik, adalah mungkin untuk mendapatkan satu set klon hibrid secara morfologi serupa dengan ESCs. Semua klon telah diasingkan pada medium terpilih di mana hanya sel-sel dengan hypoxanthine phosphoribosyltransferase aktif boleh berkembang. Analisis elektroforesis menunjukkan bahawa semua klon mempunyai varian alel ciri hipoksantin phosphoribosyltransferase bagi tikus DD/c. Analisis sitogenetik menunjukkan bahawa tiga daripada empat klon hibrid mempunyai set kromosom hampir diploid. Satu klon hampir tetraploid mengandungi dua populasi sel hibrid, satu daripadanya adalah tetraploid dan yang kedua, yang lebih kecil, adalah diploid.

Analisis mikrosatelit, yang membenarkan diskriminasi mana-mana pasangan kromosom homolog tikus 129/01a dan DD/c, dalam klon hibrid dengan set hampir diploid menunjukkan bahawa dalam dua klon terdapat penghapusan keutamaan yang jelas bagi autosom pasangan somatik. Kebanyakan autosom dalam klon HESS2 dan HESS3 mempunyai penanda garis 129/01a, iaitu, pasangan pluripoten. Pengecualian ialah kromosom 1 dan I: dalam klon HESS2 dan HESS3, bersama dengan penanda sel HM-1, penanda pasangan somatik hadir dalam kuantiti yang kecil. Keputusan sedemikian mungkin mencerminkan pengasingan kromosom 1 dan I yang tidak lengkap daripada pasangan somatik dan konsisten dengan data sitogenetik yang trisomi untuk kromosom ini diperhatikan dalam 30-40% sel klon HESS2 dan HESS3. Klon HESS4 berbeza dengan ketara dalam komposisi kromosomnya: banyak autosom dalam klon ini berasal daripada genom ESC (kromosom 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14, dan 17), tetapi kromosom 1, 9, 11, 12, 15, 8 diwakili oleh homolog. daripada kedua ibu bapa. Nisbah kuantitatif mikrosatelit yang menandakan kromosom homolog ini adalah lebih kurang 1:1. Ini membenarkan pengarang untuk menganggap bahawa satu homolog berasal dari genom ESC, dan satu lagi dari sel yang dibezakan. Dalam beberapa subklon klon HESS4, hanya penanda kromosom 18 dan 19 pasangan somatik hadir. Keputusan yang diperoleh menunjukkan bahawa dalam sel-sel klon HESS4, sebagai tambahan kepada pengasingan kromosom pasangan somatik, penghapusan satu atau kedua-dua homolog kromosom yang disenaraikan di atas genom pluripoten berlaku, iaitu, terdapat pengasingan dua hala kromosom kedua-dua ibu bapa - satu-satunya ciri kromosom yang luar biasa, kerana satu-satunya fenomena segregistik yang luar biasa. cytohybrids.

Di samping itu, selepas petikan ke-20, semua klon sel hibrid hanya mengandungi penanda kromosom X pasangan somatik, iaitu, kromosom X ESC digantikan oleh kromosom X pasangan somatik dalam klon. Fakta penting ini disahkan oleh data hibridisasi in situ menggunakan probe berlabel FITC khusus untuk kromosom X tetikus: isyarat positif dikesan hanya pada satu kromosom. Perlu diingatkan bahawa pada peringkat awal penanaman (sebelum laluan ke-15), menurut data sitogenetik, banyak sel mengandungi dua kromosom X. Oleh itu, penggunaan media terpilih membolehkan memanipulasi komposisi kromosom sel hibrid dan memilih klon secara selektif yang membawa kromosom tunggal pasangan somatik terhadap latar belakang genom ESC.

Oleh kerana ciri unik genom cytohybrid ialah penyetempatan genom ibu bapa dalam satu nukleus, persoalan secara semula jadi timbul mengenai pemeliharaan sifat pluripoten genom embrio dalam hibrid sel ESC-somatik di bawah keadaan hubungan rapatnya dengan genom sel yang dibezakan. Secara morfologi, cytohybrid ESC dan sel somatik adalah serupa dengan garis ESC ibu bapa. Penilaian pluripotensi menunjukkan bahawa semua klon dengan set kromosom hampir diploid mampu membentuk badan embrioid dalam budaya ampaian, di mana terbitan tiga lapisan kuman hadir.

Kebanyakan sel hibrid mengandungi antigen ECMA-7, ciri penanda embrio tikus awal, dan juga mempunyai aktiviti fosfatase alkali yang tinggi. Data yang paling meyakinkan tentang sifat pluripoten tinggi sel hibrid diperolehi dalam eksperimen untuk mendapatkan satu siri suntikan chimera yang melibatkan sel hibrid klon HESS2. Analisis penanda biokimia menunjukkan bahawa keturunan sel hibrid penderma terdapat dalam kebanyakan tisu chimera. Oleh itu, sel hibrid yang diperoleh dengan menggabungkan ESC dan sel dibezakan somatik mengekalkan pluripotensi pada tahap yang tinggi, termasuk keupayaan untuk membentuk chimera apabila disuntik ke dalam rongga blastokista.

Klon HESS2 dan HESS4 berbeza dengan ketara dalam komposisi kromosom ibu bapa, tetapi mempunyai sifat pluripoten yang serupa. Ia boleh diandaikan bahawa pluripotensi dalam genom hibrid menampakkan dirinya sebagai sifat dominan, tetapi ada kemungkinan bahawa tidak semua kromosom genom embrio terlibat dalam proses mengekalkan pluripotensi. Jika andaian ini betul, maka boleh dijangkakan bahawa penghapusan beberapa kromosom pasangan pluripoten daripada genom sel hibrid tidak akan disertai dengan perubahan dalam status pluripoten mereka. Dalam kes ini, analisis pengasingan kromosom ibu bapa dalam sel hibrid embrio akan membolehkan kita mendekati pengenalpastian kromosom yang bertanggungjawab untuk mengawal pluripotensi sel embrio.

O. Serov et al. (2001) tidak menemui sebarang anak dalam kalangan 50 anak yang diperoleh dengan menyilangkan chimera dengan tikus biasa yang mempunyai genotip tikus 129/01a dan membawa kromosom X tikus DD. Penulis percaya bahawa ini disebabkan oleh penurunan pluripotensi dalam sel hibrid di bawah pengaruh genom somatik. Penjelasan alternatif mungkin kesan negatif trisomi pada beberapa autosom dan ketidakseimbangan dalam kromosom seks (XXY diperhatikan dalam sel sehingga laluan ke-15) dalam sel hibrid semasa meiosis. Adalah diketahui bahawa sel XXY tidak dapat menjalani meiosis dan membentuk gamet. Trisomi juga boleh menyebabkan penurunan dalam aktiviti proliferatif sel hibrid, akibatnya kelebihan selektif dalam pembangunan chimeras mungkin tergolong dalam sel-sel embrio penerima. Oleh itu, untuk penilaian yang mencukupi tentang potensi pluripoten sel hibrid, adalah perlu untuk mendapatkan klon hibrid dengan set kromosom diploid biasa.

Dalam eksperimen O. Serov dan pengarang bersama (2001), kemungkinan memprogram semula kromosom X sel somatik dalam genom sel hibrid telah ditunjukkan buat kali pertama. Kesimpulan pengarang ini mengikuti analisis ekspresi gen hprt (penanda kromosom X) dalam chimera: kehadiran varian alel hprt DD/c tikus dikesan dalam semua tisu chimeric yang dianalisis. Adalah wajar untuk menekankan bahawa selepas pengenalan sel hibrid ke dalam rongga blastokista, cytohybrids jatuh ke dalam keadaan tidak selektif dan pemeliharaan kromosom X dalam genom sel hibrid bermakna ia telah menjadi komponen wajibnya dan genom tidak mendiskriminasikannya daripada kromosom Y pasangan pluripoten.

Merumuskan hasil analisis interaksi genom somatik dan pluripoten dalam sel embrio hibrid, penulis menyimpulkan bahawa dalam beberapa cytohybrids pluripotensi ditunjukkan sebagai sifat dominan. Genom hibrid mampu memprogram semula kromosom individu sel yang dibezakan, yang bagaimanapun, tidak mengecualikan kemungkinan kesan terbalik genom somatik pada pluripotensi genom embrio. Apabila membiak sel hibrid, induksi pembezaan berlaku dengan ketara lebih kerap daripada dalam barisan ibu bapa asal ESCs HM-1. Kesan yang sama diperhatikan semasa pembentukan koloni primer: banyak koloni utama sel hibrid embrio dibezakan pada peringkat awal pembentukan dengan kehilangan besar klon semasa pemilihan dan pembiakan mereka.

Oleh itu, cytohybrids yang dicipta oleh gabungan ESC dengan sel somatik, walaupun bersentuhan rapat dengan genom sel yang dibezakan, mengekalkan pluripotensi sebagai sifat unik genom embrio. Selain itu, dalam sel hibrid tersebut, pengaturcaraan semula kromosom individu yang berasal daripada sel yang dibezakan adalah mungkin. Ia masih tidak jelas sejauh mana sifat pluripoten genom embrio dikekalkan dalam sel hibrid, khususnya, keupayaan mereka untuk mengambil bahagian dalam pembentukan garis kuman dalam chimera. Ini memerlukan mendapatkan sel hibrid embrio dengan karyotype normal. Walau apa pun, sel hibrid embrionik pluripoten boleh menjadi model genetik sebenar untuk mengenal pasti kromosom yang terlibat dalam mengekalkan pluripotensi atau mengawalnya, kerana pengasingan dua hala kromosom ibu bapa berpotensi memberikan peluang sedemikian.

Tidak kurang menarik ialah kajian fenomena yang O. Serov et al. (2001) mendefinisikan sebagai "memori kromosom". Dalam genom hibrid, kromosom homolog berada dalam dua konfigurasi alternatif: homolog pasangan somatik pernah mengalami pembezaan, manakala dalam homolog pasangan pluripoten proses ini baru bermula. Akibatnya, pemeliharaan sifat pluripoten tinggi oleh sel hibrid menunjukkan bahawa konfigurasi "pluripoten" homolog ESC cukup stabil dalam genom hibrid, walaupun terdapat pengaruh faktor transaksi yang berasal dari pasangan somatik. Tanda-tanda pemrograman semula kromosom homolog genom yang diterangkan di atas semasa pembangunan chimera tidak mengecualikan kemungkinan bahawa pada peringkat pertama pembentukan dan penanaman cytohybrids in vitro mereka mengekalkan status mereka yang diperoleh semasa pembezaan in vivo. Menurut data yang diperoleh baru-baru ini, apabila sel hibrid embrio dipindahkan ke persekitaran tidak selektif, mereka menunjukkan penghapusan intensif kromosom hanya pasangan somatik, iaitu, genom sel hibrid mudah mendiskriminasi homolog selepas penanaman in vitro selama 10-15 laluan. Oleh itu, sel hibrid embrio mewakili model eksperimen yang menjanjikan untuk mengkaji bukan sahaja sifat asas genom embrio sebagai pluripotensi, tetapi juga alternatifnya - pembezaan embrio.

Keberkesanan terapeutik pemindahan sel stem embrio

Sebelum menganalisis keberkesanan terapeutik pemindahan ESC dan derivatifnya, kami meringkaskan bahan di atas. Keupayaan ESC dari segi pelaksanaan penuh embriogenesis in vitro tidak mencukupi, kerana kecacatan perkembangan dalam kes ini disebabkan oleh ketiadaan sel stem mesenchymal, yang timbul di dalam badan secara autonomi dan bebas daripada ESC. Potensi genetik ESC adalah kurang daripada potensi genetik zigot, oleh itu ESC tidak digunakan secara langsung untuk pengklonan embrio. Potensi biologi unik ESC sebagai satu-satunya sel di mana program pembangunan digunakan sepenuhnya dalam pelaksanaan yang konsisten digunakan dalam kajian fungsi gen. Dengan bantuan ESC, kombinasi pertama isyarat yang mengaktifkan ekspresi gen awal dan lewat yang mengekodkan pembangunan tiga lapisan kuman dinyahkodkan. Pemeliharaan pluripotensi genom ESC secara in vitro menjadikannya alat unik untuk penjanaan semula reparatif, yang mampu mengisi semula kehilangan selular secara automatik sekiranya berlaku kerosakan pada organ dan tisu. Dalam senario hipotesis yang ideal, boleh diandaikan bahawa “... apabila memindahkan ESC penderma, program yang padat dipindahkan ke dalam badan penerima, yang, dalam keadaan yang menggalakkan, direalisasikan dalam pembinaan tisu baharu'7, yang mampu “... disepadukan dengan berkesan ke dalam badan penerima pada tahap morfologi dan fungsian.”

Sememangnya, berikutan pembangunan kaedah untuk monodifferentiation ESC, kajian in vivo mengenai aktiviti fungsi sel yang diperoleh secara in vitro daripada satu klon khusus bermula. Klon ESC yang membiak menjana populasi sel progenitor yang berhijrah yang benar-benar mampu menyepadukan secara aktif ke dalam kawasan kerosakan tisu penerima, yang digunakan dalam perubatan regeneratif-plastik. Telah ditubuhkan bahawa pemindahan neuron DOPA ke dalam substantia nigra mengurangkan manifestasi klinikal dalam hemiparkinsonisme eksperimen. Pemindahan serantau bagi sel stem saraf penderma mengurangkan tahap gangguan motor yang disebabkan oleh trauma atau lebam saraf tunjang dan otak. Keputusan positif pertama pemindahan sel stem dalam penyakit demielinasi juga telah diperolehi. Nampaknya potensi plastik regeneratif ESC membuka kemungkinan tanpa had untuk penggunaan pemindahan sel dalam perubatan praktikal. Walau bagaimanapun, apabila dipindahkan ke zon ektopik, ESC pasti berubah menjadi tumor. Teratoma terbentuk apabila ESC disuntik secara subkutan ke dalam tikus immunodeficient. Apabila suspensi ESC dipindahkan di bawah kapsul testis pada tikus syngeneik, teratoma juga terbentuk, yang terdiri daripada tisu yang berbeza, sel-selnya adalah derivatif dari ketiga-tiga lapisan kuman. Dalam teratoma sedemikian, proses pengurangan organogenesis sangat jarang berlaku.

Beberapa kajian memberikan maklumat tentang hasil positif pemindahan derivatif ESC awal kepada haiwan dengan patologi eksperimen. Transplantasi saraf selular menggunakan derivatif ESC sedang dibangunkan lagi dalam eksperimen dan ujian klinikal pertama untuk membetulkan gangguan fungsi dalam kecederaan otak dan tulang belakang, dan untuk merawat syringomyelia dan multiple sclerosis (Repin, 2001). Dengan kemunculan teknik neurogenesis in vitro daripada ESC, bukannya menggunakan tisu otak embrio, kaedah sedang dibangunkan untuk pemindahan derivatif neurosfera yang diperoleh daripada kultur tisu saraf embrio. Penggantungan pemindahan sedemikian jauh lebih homogen dan mengandungi prekursor neuron dan neuroglia yang komited.

Dengan penambahan biasa asid retinoik pada dos 10 μg/ml ke medium kultur selama 6 minggu, lebih daripada 80% neuron postmitotic terbentuk dalam garisan karsinoma embrio-(terato)-2 NTERA-2 manusia. Kehomogenan lengkap populasi neuron dicapai dengan pengasingan aliran neuron matang yang dilabelkan dengan penanda immunophenotypic, yang membolehkan menyingkirkan sisa teratokarsinoma dan sel tidak matang. Selepas pemindahan ke pelbagai kawasan otak haiwan eksperimen, neuron tersebut bukan sahaja bertahan, tetapi juga berintegrasi ke dalam rangkaian saraf serantau. Pada haiwan dengan model eksperimen kecacatan CNS tempatan, pemindahan saraf mengurangkan manifestasi klinikal patologi manusia seperti akibat kecederaan otak traumatik, strok, penyakit demielinasi, kecacatan keturunan dalam perkembangan cerebellum, penyakit pemendapan lipid dan polisakarida.

Untuk mengoptimumkan proses penjanaan semula dalam penyakit degeneratif sistem saraf pusat, teknologi sedang dibangunkan untuk mendapatkan oligodendrosit penghasil myelin daripada ESC. Peringkat pertama secara tradisinya merangkumi percambahan ESC dengan pembiakan bilangan sel yang diperlukan untuk pemindahan. Pada peringkat kedua, pembezaan sel yang disasarkan kepada populasi prekursor oligodendrocyte penghasil myelin dijalankan, yang dikawal oleh antigen penanda terpilih.

Prospek tertentu dibuka untuk penggunaan derivatif ESC untuk pembangunan kaedah untuk membetulkan kekurangan imun yang disebabkan oleh kecacatan genetik dalam pematangan timus. Dalam kajian mengenai tikus kalah mati (kain 1) dengan kecacatan gen yang disebabkan - gangguan mekanisme penggabungan semula lokus V(D)J gen TCR, yang membawa kepada kehilangan fungsi T-limfosit, pemindahan derivatif ESC awal ke dalam timus haiwan memulihkan kematangan populasi normal klon imun yang bertanggungjawab terhadap immun selular. Percubaan klinikal pemindahan ESC prabentuk in vitro untuk rawatan anemia keturunan yang membawa maut pada kanak-kanak sedang dijalankan.

Bantahan terhadap pengenalan pantas pemindahan sel stem ke dalam klinik adalah berdasarkan bilangan garisan stabil sel stem embrio manusia yang terhad dan keperluan untuk penyeragaman mereka. Untuk meningkatkan ketulenan garis ESC piawai, serta sel stem manusia dewasa, adalah dicadangkan untuk menggunakan kaedah pemilihan garis berdasarkan analisis genetik molekul ulangan DNA tandem pendek. Ia juga perlu untuk menguji garis ESC untuk kehadiran penyusunan semula kromosom kecil dan mutasi genetik, potensi yang berlaku di bawah keadaan kultur sel adalah agak tinggi. Satu tesis dikemukakan tentang ujian mandatori bagi sifat-sifat semua jenis ESC dan sel stem pluripoten serantau, kerana pembiakan mereka secara in vitro boleh membawa kepada kemunculan ciri-ciri baru yang tidak wujud dalam sel stem embrio atau tisu definitif. Khususnya, diandaikan bahawa penanaman jangka panjang dalam media dengan sitokin membawa garisan ESC lebih dekat kepada sel tumor, kerana mereka mengalami perubahan yang sama dalam laluan peraturan kitaran sel dengan pemerolehan keupayaan untuk menjalankan bilangan pembahagian sel yang tidak terhad. Sesetengah pengarang, berdasarkan potensi perkembangan tumor, menganggap pemindahan derivatif sel stem embrionik awal ke dalam manusia sebagai melulu. Pada pendapat mereka, adalah lebih selamat untuk menggunakan keturunan ESC yang komited, iaitu, barisan progenitor sel yang dibezakan. Walau bagaimanapun, pada masa ini, teknik yang boleh dipercayai untuk mendapatkan garisan sel manusia yang stabil yang membezakan ke arah yang dikehendaki belum lagi dibangunkan.

Oleh itu, semakin banyak data mengenai kesan terapeutik positif pemindahan derivatif sel stem embrio manusia muncul dalam kesusasteraan. Walau bagaimanapun, banyak kajian ini sedang dikaji dan dikritik. Sesetengah penyelidik percaya bahawa keputusan ujian klinikal awal adalah bersifat awal dan hanya menunjukkan bahawa sel stem mampu memberi kesan yang baik terhadap perjalanan klinikal penyakit tertentu. Oleh itu, adalah perlu untuk mendapatkan data mengenai hasil jauh pemindahan sel. Peringkat perkembangan neurotransplantologi klinikal disebut sebagai hujah. Malah, pada mulanya, penerbitan mengenai kecekapan tinggi pemindahan serpihan otak embrio dalam penyakit Parkinson berlaku dalam kesusasteraan, tetapi kemudian laporan mula muncul menafikan kecekapan terapeutik tisu saraf embrio atau janin yang dipindahkan ke otak pesakit.

Ujian klinikal pertama telah dijalankan untuk menilai keselamatan pemindahan neuroblas yang diperoleh daripada ESC teratokarsinoma NTERA-2, sel yang tidak matang yang tertakluk kepada percambahan dalam kultur sehingga pengumpulan 100 juta jisim sel. Beberapa sel yang diperoleh dengan cara ini digunakan untuk mencirikan fenotip dan menentukan kekotoran selular, serta untuk menguji kemungkinan pencemaran dengan virus dan bakteria. LIF dan lapisan penyuap sel stromal janin telah dikeluarkan dari medium kultur, dan keadaan dicipta untuk pembezaan sasaran ESC ke dalam neuroblas menggunakan gabungan sitokin dan faktor pertumbuhan. Kemudian neuroblas telah disucikan daripada sel teratokarsinoma yang belum matang pada pengasing sel aliran. Selepas penulenan sekunder dan pencirian fenotip sel yang dipindahkan, penggantungan neuroblas (10-12 juta) disuntik ke dalam nukleus basal otak pesakit (pada bulan ketujuh selepas strok hemoragik) menggunakan microcannula dan picagari khas di bawah kawalan tomografi stereotaksik dan terkira. Pemeriksaan selepas pemindahan satu tahun akibat pemindahan neuron ke zon strok tidak mendedahkan sebarang kesan sampingan atau tidak diingini. Separuh daripada pesakit menunjukkan peningkatan dalam fungsi motor dalam tempoh dari 6 hingga 12 bulan selepas pemindahan. Perubahan klinikal yang positif disertai dengan peningkatan bekalan darah ke zon strok selepas pemindahan sel: peningkatan purata dalam penyerapan pendarfluor berlabel 2-deoxyglucose, mengikut tomografi pelepasan positron, mencapai 18%, dan dalam sesetengah pesakit - 35%.

Walau bagaimanapun, Institut Kesihatan Kebangsaan AS menjalankan kajian bebas tentang keberkesanan klinikal pemindahan saraf pada pesakit dengan Parkinsonisme. Pesakit dalam kumpulan pertama telah dipindahkan dengan bahagian tisu saraf embrio yang menghasilkan dopamin, manakala kumpulan kedua pesakit menjalani pembedahan palsu. Keputusan menunjukkan sifar keberkesanan klinikal neurotransplantasi sedemikian, walaupun pada hakikatnya neuron embrionik penghasil dopamin terselamat dalam otak penerima. Lebih-lebih lagi, 2 tahun selepas pemindahan tisu saraf embrio, 15% pesakit mengalami dyskinesia berterusan, yang tidak hadir pada pesakit dalam kumpulan plasebo (Sel stem: kemajuan saintifik dan arahan penyelidikan masa depan. Nat. Inst, of Health. USA). Pemerhatian perkembangan lanjut penyakit pada pesakit ini sedang dijalankan.

Sesetengah penulis mengaitkan data kesusasteraan yang bercanggah mengenai penilaian keberkesanan klinikal neurotransplantasi dengan pendekatan yang berbeza untuk pemilihan kumpulan pesakit, pilihan kaedah yang tidak mencukupi untuk menilai keadaan mereka secara objektif, dan, yang paling penting, tempoh perkembangan tisu saraf embrio yang berbeza dan kawasan otak yang berbeza dari mana tisu ini diperolehi, saiz pemindahan yang berbeza dan ciri-ciri metodologi campur tangan pembedahan.

Perlu diingatkan bahawa percubaan pemindahan langsung sel stem embrionik pluripoten ke kawasan striatum otak tikus dengan hemiparkinsonisme eksperimen disertai dengan percambahan ESC dan pembezaan mereka ke dalam neuron dopaminergik. Perlu diandaikan bahawa neuron yang baru terbentuk telah disepadukan dengan berkesan ke dalam rangkaian saraf, kerana selepas pemindahan ESC, pembetulan anomali tingkah laku dan asimetri motor dalam ujian apomorphine diperhatikan. Pada masa yang sama, beberapa haiwan mati akibat transformasi ESC yang dipindahkan menjadi tumor otak.

Pakar dari Akademi Kebangsaan dan Perubatan Amerika Syarikat, pakar dari Institut Kesihatan Kebangsaan Amerika Syarikat percaya bahawa potensi klinikal ESC patut diberi perhatian yang paling serius, tetapi menegaskan keperluan untuk kajian terperinci sifat-sifat mereka, kemungkinan komplikasi dan akibat jangka panjang dalam eksperimen ke atas model biologi yang mencukupi bagi penyakit manusia (Sel stem. Stem the future Academy of the future. Nat. Inst, dari Health USA).

Dari sudut pandangan ini, adalah penting bahawa analisis histologi perbandingan teratoma eksperimen yang diperolehi dengan pemindahan suspensi ESC ke dalam testis dengan teratoma yang terbentuk akibat pemindahan embrio awal, yang juga mengandungi ESC, menunjukkan bahawa ESC, tanpa mengira sumber asal atau interaksi dengan sel sekeliling tertentu, melaksanakan potensi tumorigenik mereka dengan cara yang sama. Telah terbukti bahawa teratoma sedemikian mempunyai asal klon, kerana tumor yang terdiri daripada derivatif ketiga-tiga lapisan kuman boleh timbul daripada satu ESC (Rega, 2001). Perlu diperhatikan bahawa apabila ESC yang diklon dengan karyotype normal telah dipindahkan ke dalam tikus immunodeficient, teratoma yang terdiri daripada pelbagai jenis sel somatik yang berbeza juga terbentuk. Data eksperimen ini adalah bukti yang sempurna tentang asal klon teratoma. Dari sudut pandangan biologi perkembangan, mereka menunjukkan bahawa bukan beberapa sel progenitor yang komited, tetapi satu sel stem pluripoten tunggal bertindak sebagai sumber derivatif yang berbeza bagi ketiga-tiga lapisan kuman yang membentuk teratoma. Walau bagaimanapun, dalam laluan ke pemindahan sel praktikal, hasil kajian ini, jika tidak melarang, maka tanda amaran potensi bahaya, sejak inokulasi ESC atau sel kuman primordial ke dalam pelbagai tisu tikus immunodeficient dewasa tidak dapat tidak menyebabkan perkembangan tumor daripada sel stem yang dipindahkan. Degenerasi neoplastik ESC yang dipindahkan secara ektopik disertai dengan kemunculan populasi satelit sel yang dibezakan - disebabkan oleh pembezaan separa ESC dan klon progenitor ke dalam talian khusus. Menariknya, apabila ESC dipindahkan ke dalam otot rangka, neuron paling kerap terbentuk di sebelah sel teratokarsinoma. Walau bagaimanapun, pengenalan ESC ke dalam telur pembahagi atau blastokista disertai dengan penyepaduan lengkap sel ke dalam embrio tanpa pembentukan unsur neoplastik. Dalam kes ini, ESC disepadukan ke dalam hampir semua organ dan tisu embrio, termasuk primordium alat kelamin. Haiwan allophene sedemikian mula-mula diperoleh dengan memperkenalkan sel teratokarsinoma 129 ke dalam embrio awal pada peringkat 8-100 sel. Dalam tikus allophene, populasi sel heterogen yang berasal daripada ESC penderma disepadukan ke dalam tisu sumsum tulang, usus, kulit, hati dan alat kelamin, yang memungkinkan untuk mencipta chimera sel interspesies walaupun dalam eksperimen. Semakin pendek tempoh perkembangan embrio awal, semakin tinggi peratusan chimerization sel, dengan tahap chimerization tertinggi diperhatikan dalam sistem hematopoietik, kulit, sistem saraf, hati, dan usus kecil embrio alofen. Dalam organisma dewasa, tisu yang dilindungi daripada sistem imun penerima oleh halangan histohematik terdedah kepada chimerization:pemindahan sel kuman primer ke dalam parenkim testis disertai dengan penggabungan sel stem penderma ke dalam lapisan tisu germinal penerima. Walau bagaimanapun, Apabila memindahkan ESC ke dalam blastokista, pembentukan asas chimeric organ seksual dengan penjanaan sel kuman primer penderma tidak berlaku. Kemajmukan ESC, apabila keadaan khas dicipta, juga boleh digunakan untuk pengklonan: memindahkan ESC tetikus ke dalam embrio tikus 8-16 sel, di mana mitosis selular disekat oleh sitokalsin, menggalakkan pelaksanaan embriogenesis normal dengan perkembangan embrio daripada ESC penderma.

Oleh itu, alternatif kepada pemindahan ESC alogenik ialah pengklonan terapeutik berdasarkan pemindahan nukleus sel somatik ke dalam telur yang dienukleasi untuk mencipta blastokista, daripada jisim sel dalam yang mana garisan ESC yang serupa secara genetik dengan penderma nukleus somatik kemudian diasingkan. Secara teknikal, idea ini agak boleh dilaksanakan, kerana kemungkinan mencipta garisan ESC daripada blastokista yang diperoleh selepas pemindahan nukleus somatik ke dalam telur berenukleasi telah berulang kali dibuktikan dalam eksperimen ke atas haiwan makmal (Nagy, 1990; Munsie, 2000). Khususnya, pada tikus homozigot untuk mutasi gen rag2, fibroblas yang diperolehi dengan mengkultur sel tisu subepidermis digunakan sebagai penderma nukleus, yang dipindahkan ke dalam oosit yang dienukleasi. Selepas pengaktifan oosit, "zigot" dibiakkan sehingga pembentukan blastokista, dari jisim sel dalam yang mana ESC diasingkan dan dipindahkan ke garisan sel nullizygous untuk gen mutan (rag2~/~). Mutasi satu gen alel telah diperbetulkan dalam ESC sedemikian dengan kaedah penggabungan semula homolog. Dalam siri pertama eksperimen, badan embrioid diperolehi daripada ESC dengan gen yang dipulihkan rekombinan, sel-sel mereka ditransfeksi dengan retrovirus rekombinan (HoxB4i/GFP) dan, selepas pembiakan, disuntik ke dalam vena rag2~/~ tikus. Dalam siri kedua, blastomer tetraploid telah diagregatkan dengan ESC yang diubah suai secara genetik dan dipindahkan ke dalam wanita penerima. Tikus imunokompeten yang terhasil berfungsi sebagai penderma sumsum tulang untuk pemindahan ke dalam tikus mutan rag2~/~. Dalam kedua-dua siri keputusannya adalah positif: selepas 3-4 minggu sel myeloid dan limfoid normal yang matang yang mampu menghasilkan imunoglobulin ditemui pada semua tikus. Oleh itu, pemindahan nukleus sel somatik ke dalam oosit boleh digunakan bukan sahaja untuk mendapatkan garis ESC, tetapi juga untuk sitogenoterapi - pembetulan anomali keturunan, menggunakan ESC sebagai vektor untuk pengangkutan maklumat genetik pembetulan. Tetapi arah pemindahan sel ini, sebagai tambahan kepada masalah bioetika, mempunyai batasannya. Tidak jelas sejauh mana pemindahan sel klon terapeutik dengan genotip yang sama dengan genotip pesakit tertentu akan selamat, kerana sel tersebut boleh memperkenalkan mutasi yang mewujudkan kecenderungan kepada penyakit lain. Telur manusia biasa kekal sebagai objek yang sukar diakses, manakala walaupun dengan pemindahan nukleus somatik ke dalam telur haiwan yang dienukleasi, hanya 15-25% daripada "zigot" yang dibina berkembang ke peringkat blastokista. Ia masih belum ditentukan berapa banyak blastokista yang diperlukan untuk mendapatkan satu baris ESC klon pluripoten. Ia juga perlu diperhatikan tahap tinggi kos kewangan yang berkaitan dengan kerumitan metodologi pengklonan terapeutik.

Kesimpulannya, perlu diingatkan bahawa dalam ESC, pluripotensi genom dengan DNA hypomethylated digabungkan dengan aktiviti telomerase yang tinggi dan fasa C^ pendek kitaran sel, yang memastikan pembiakan intensif dan berpotensi tidak terhingga mereka, di mana ESC mengekalkan set kromosom diploid dan set ciri fenotip "juvana". Pertumbuhan klon ESC dalam kultur tidak mengganggu pembezaan mereka ke dalam mana-mana garis sel khusus organisma apabila percambahan dihentikan dan isyarat pengawalseliaan yang sesuai ditambah. Pembezaan sekatan ESC ke dalam garisan sel somatik secara in vitro direalisasikan tanpa penyertaan mesenkim, memintas Nochteys, organogenesis luar dan tanpa pembentukan embrio. Pengenalan ektopik ESC dalam vivo tidak dapat dielakkan membawa kepada pembentukan teratokarsinoma. Pemindahan ESC ke dalam blastokista atau embrio awal disertai dengan integrasi mereka dengan tisu embrio dan chimerisasi stabil organnya.

Teknologi regeneratif-plastik berdasarkan pemindahan sel adalah titik persilangan kepentingan wakil biologi sel, biologi perkembangan, genetik eksperimen, imunologi, neurologi, kardiologi, hematologi dan banyak lagi cabang perubatan eksperimen dan praktikal. Keputusan kajian eksperimen yang paling penting membuktikan kemungkinan pemrograman semula sel stem dengan perubahan yang disasarkan dalam sifatnya, yang membuka prospek untuk mengawal proses pembezaan sitodogen menggunakan faktor pertumbuhan - untuk penjanaan semula miokardium, pemulihan lesi CNS dan normalisasi fungsi alat pulau kecil pankreas. Walau bagaimanapun, untuk pengenalan meluas pemindahan derivatif ESC ke dalam perubatan praktikal, adalah perlu untuk mengkaji sifat sel stem manusia dengan lebih terperinci dan meneruskan eksperimen dengan ESC pada model penyakit eksperimen.

Isu bioetika dan masalah penolakan pemindahan sel alogenik boleh diselesaikan dengan keplastikan yang ditemui bagi genom sel stem serantau bagi organisma dewasa. Walau bagaimanapun, maklumat awal bahawa apabila memindahkan sel autologous hematopoietik yang terpencil dan dicirikan dengan teliti ke dalam hati, dari mana hepatosit baru diperoleh, berintegrasi ke dalam lobul hati, kini sedang disemak dan dikritik. Walau bagaimanapun, data telah diterbitkan bahawa pemindahan sel stem saraf ke dalam timus menyebabkan pembentukan pucuk T- dan B-limfosit penderma baru, dan pemindahan sel stem saraf otak ke dalam sumsum tulang membawa kepada pembentukan pucuk hematopoietik dengan myelo- dan erythropoiesis penderma jangka panjang. Akibatnya, sel stem pluripoten yang mampu memprogram semula genom kepada potensi ESC boleh kekal dalam organ organisma dewasa.

Sumber untuk mendapatkan ESC untuk tujuan perubatan kekal sebagai embrio manusia, yang menentukan tidak dapat dielakkan persimpangan baru isu moral, etika, undang-undang dan agama pada titik asal kehidupan manusia. Penemuan ESC telah memberikan dorongan yang kuat kepada penyambungan semula perbincangan yang sukar tentang di mana garis antara sel hidup dan jirim, makhluk dan personaliti. Pada masa yang sama, tidak ada norma, peraturan dan undang-undang sejagat mengenai penggunaan ESC dalam perubatan, walaupun percubaan berulang untuk mencipta dan menerima pakainya. Setiap negeri, dalam rangka perundangannya, menyelesaikan masalah ini secara bebas. Bagi pihak mereka, doktor di seluruh dunia terus mencuba untuk mengambil ubat plastik regeneratif di luar skop perbincangan sedemikian, terutamanya melalui penggunaan rizab sel stem dewasa dan bukannya sel stem embrio.

Sedikit sejarah pengasingan sel stem embrio

Sel karsinoma terato(embrio) telah diasingkan daripada teratoma testis yang berlaku secara spontan bagi tikus 129/ter-Sv, teratoma ovari spontan tikus Lt/Sv, dan daripada teratoma yang diperoleh daripada sel atau tisu embrio yang dipindahkan secara ektopik. Di antara garisan sel karsinoma terato(embrio) tetikus yang stabil yang diperoleh dengan cara ini, ada yang pluripoten, yang lain dibezakan hanya kepada satu jenis sel tertentu, dan ada yang tidak dapat pembezaan sitodontik sepenuhnya.

Pada satu masa, tumpuan diberikan kepada kajian yang hasilnya menunjukkan kemungkinan mengembalikan sel terato-(embrio)-karsinoma kepada fenotip normal selepas pengenalannya ke dalam tisu embrio yang sedang berkembang, serta mengusahakan penciptaan in vitro sel terato-(embrio)-karsinoma yang diubah suai secara genetik, dengan bantuan pemodelan mutan biologi manusia diperolehi.

Penanaman ampaian berhawa dingin digunakan untuk mengasingkan garisan sel terato-(embrio)-karsinoma. Dalam kultur, sel terato-(embrio)-karsinoma, seperti ESC, tumbuh untuk membentuk badan embrioid dan memerlukan pemisahan mandatori untuk pemindahan talian, mengekalkan pluripotensi pada lapisan penyuap fibroblas embrio atau semasa penanaman ampaian dalam medium berhawa dingin. Sel-sel garisan terato-(embrio)-karsinoma pluripoten adalah besar, sfera, dicirikan oleh aktiviti fosfatase beralkali tinggi, membentuk agregat dan mampu melakukan pembezaan pelbagai arah. Apabila dimasukkan ke dalam blastokista, ia beragregat dengan morula, yang membawa kepada pembentukan embrio chimeric, dalam komposisi pelbagai organ dan tisu yang mana derivatif sel terato-(embrio)-karsinoma ditemui. Walau bagaimanapun, kebanyakan embrio chimeric seperti itu mati dalam rahim, dan dalam organ chimera baru lahir yang masih hidup, sel asing jarang dikesan dan pada ketumpatan rendah. Pada masa yang sama, kejadian tumor (fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, jenis tumor malignan lain dan adenoma pankreas) meningkat dengan mendadak, dan degenerasi tumor sering berlaku semasa tempoh perkembangan intrauterin embrio chimeric.

Kebanyakan sel terato-(embrio)-karsinoma dalam persekitaran mikro sel embrio normal hampir secara semula jadi memperoleh ciri-ciri neoplastik malignan. Adalah dipercayai bahawa keganasan tidak dapat dipulihkan adalah disebabkan oleh pengaktifan proto-onkogen dalam proses penyusunan semula struktur. Salah satu pengecualian ialah sel-sel garisan embriokarsinoma SST3, yang diperoleh daripada teratoma testis tikus (baris 129/Sv-ter), yang mempamerkan keupayaan tinggi untuk berintegrasi ke dalam tisu dan organ embrio tanpa pembentukan tumor berikutnya dalam tikus chimeric. Derivatif garisan sel terato-(embrio)-karsinoma dalam tikus chimeric secara praktikal tidak mengambil bahagian dalam pembentukan gonosit primer. Nampaknya, ini disebabkan oleh kekerapan tinggi penyimpangan kromosom ciri kebanyakan terato-(embrio)-karsinoma, dalam sel-sel yang kedua-dua aneuploidi dan keabnormalan kromosom diperhatikan.

Beberapa garisan stabil sel terato-(embrio)-karsinoma manusia yang dicirikan oleh pluripotensi, aktiviti proliferatif yang tinggi dan keupayaan untuk membezakan semasa pertumbuhan dalam kultur diperolehi dalam keadaan makmal. Khususnya, barisan sel terato-(embrio)-karsinoma manusia NTERA-2 digunakan untuk mengkaji mekanisme sitodiferensiasi saraf. Selepas pemindahan sel-sel garis ini ke kawasan subventrikular otak depan tikus yang baru lahir, penghijrahan dan neurogenesis mereka diperhatikan. Percubaan juga dilakukan untuk memindahkan neuron yang diperolehi dengan mengkultur sel-sel terato-(embrio)-karsinoma NTERA-2 kepada pesakit dengan strok, yang, menurut pengarang, membawa kepada peningkatan dalam perjalanan klinikal penyakit ini. Pada masa yang sama, tiada kes keganasan sel yang dipindahkan dari terato-(embrio)-karsinoma talian NTERA-2 pada pesakit strok.

Baris pertama sel stem embrionik tetikus pluripotent yang tidak dibezakan diperoleh pada awal 1980-an oleh Evans dan Martin, yang mengasingkannya daripada jisim sel dalaman blastokista - embrioblast. Garis ESC terpencil mengekalkan pluripotensi dan keupayaan untuk membezakan ke dalam pelbagai jenis sel di bawah pengaruh faktor dalam medium kultur khas untuk masa yang lama.

Istilah "sel stem pluripotent embrionik" sendiri adalah milik Leroy Stevens, yang, semasa mengkaji kesan tar tembakau pada kejadian perkembangan tumor, menarik perhatian kepada kejadian spontan teratokarsinoma testis dalam tikus linear (129/v) kumpulan kawalan. Sel-sel teratokarsinoma testis dicirikan oleh kadar percambahan yang tinggi, dan dengan kehadiran cecair dari rongga perut mereka secara spontan dibezakan dengan pembentukan neuron, keratinosit, kondrosit, kardiomiosit, serta serpihan rambut dan tulang, tetapi tanpa sebarang tanda-tanda sitoarkitektur tisu yang sesuai. Apabila diletakkan dalam kultur, sel teratokarsinoma berkembang sebagai klon pluripoten yang tidak terikat pada substrat dan membentuk badan embrioid, selepas itu ia berhenti membahagikan dan mengalami pembezaan tidak teratur spontan kepada neuron, glia, sel otot, dan kardiomiosit. Stevens mendapati bahawa teratokarsinoma tetikus 129/v mengandungi kurang daripada 1% sel yang mampu membezakan ke dalam pelbagai garis somatik khusus, dan pembezaan itu sendiri bergantung pada faktor yang mempengaruhinya (komposisi cecair peritoneal, produk sel matang atau tisu yang ditambahkan pada kultur). Hipotesis Leroy Stevenson tentang kehadiran sel-sel progenitor embrio dalam barisan kuman di kalangan sel teratokarsinoma telah disahkan: penggantungan sel embrioblast daripada embrio praimplantasi dalam tisu tikus dewasa membentuk teratokarsinoma, dan garisan sel tulen diasingkan daripada mereka selepas pentadbiran intraperitoneal kepada semua haiwan penerima dibezakan kepada tiga sel neuron kardiomiomatik yang lain. lapisan kuman. Dalam eksperimen in vivo, pemindahan ESCs (diperolehi daripada embrioblast, tetapi bukan trofoblas) ke dalam embrio tetikus barisan lain pada peringkat blastomere 8-32 mengakibatkan kelahiran haiwan chimeric (tanpa perkembangan tumor), di mana organ-organ tunas tisu penderma ditemui. Chimerism diperhatikan walaupun dalam garis sel kuman.

Sel-sel kuman progenitor utama diasingkan daripada asas kemaluan embrio tikus yang sepadan dalam morfologi, fenotip imunologi dan ciri-ciri fungsi kepada ESC yang diperoleh oleh Stevenson daripada teratokarsinoma dan embrioblast. Dalam chimera yang dilahirkan selepas ESC diperkenalkan ke dalam blastokista, morfogenesis alofen organ dicirikan oleh selang mozek penderma dan penerima unit struktur dan fungsi hati, paru-paru dan buah pinggang. Dalam sesetengah kes, pembentukan crypts usus atau lobulus hati yang terdiri daripada kedua-dua sel penerima dan penderma diperhatikan. Walau bagaimanapun, morfogenesis sentiasa direalisasikan mengikut program genetik spesies yang menjadi milik penerima, dan chimerism terhad secara eksklusif kepada peringkat selular.

Ia kemudiannya ditubuhkan bahawa percambahan ESC tanpa pembezaan sitod pada lapisan penyuap sel yang berasal dari mesenkim (fibroblas janin) berlaku dengan kehadiran wajib LIF dalam media nutrien terpilih, yang secara selektif memastikan kemandirian hanya sel stem dan progenitor, manakala sebahagian besar unsur selular khusus mati. Dengan menggunakan kaedah sedemikian, pada tahun 1998 James Thomson mengasingkan lima baris sel stem embrionik yang diabadikan daripada jisim sel dalaman blastokista manusia. Pada tahun yang sama, John Gerhart membangunkan kaedah untuk mengasingkan garis ESC abadi daripada tuberkel kemaluan embrio manusia berumur empat hingga lima minggu. Disebabkan sifat uniknya, hanya dua tahun kemudian, sel stem embrio dan sel stem tisu definitif mula digunakan dalam amalan perubatan regeneratif dan terapi gen.