Kaedah genetik molekul untuk mendiagnosis penyakit keturunan

Kaedah teknologi DNA digunakan untuk menentukan penyetempatan gen mutan dalam kromosom tertentu, yang bertanggungjawab untuk asal-usul bentuk patologi keturunan tertentu. Oleh kerana gen adalah bahagian DNA, dan mutasi gen adalah kerosakan pada struktur utama DNA (mutasi difahami sebagai semua perubahan dalam urutan DNA, tanpa mengira penyetempatan dan kesannya terhadap daya maju individu), maka, dengan meneliti persediaan kromosom metafasa pesakit dengan penyakit keturunan, adalah mungkin untuk mewujudkan penyetempatan gen patologi. Kaedah genetik molekul mencipta peluang untuk mendiagnosis penyakit pada tahap struktur DNA yang diubah, mereka membolehkan kita menentukan penyetempatan gangguan keturunan. Kaedah genetik molekul boleh mengenal pasti mutasi yang berkaitan dengan penggantian walaupun satu asas tunggal.

Peringkat paling penting dalam pengenalan gen ialah pengasingannya. DNA boleh diasingkan daripada sebarang jenis tisu dan sel yang mengandungi nukleus. Peringkat pengasingan DNA termasuk: lisis cepat sel, penyingkiran serpihan organel dan membran selular dengan sentrifugasi, pemusnahan enzimatik protein dan pengekstrakan mereka daripada larutan menggunakan fenol dan kloroform, kepekatan molekul DNA melalui pemendakan dalam etanol.

Dalam makmal genetik, DNA paling kerap diasingkan daripada leukosit darah, yang mana 5-20 ml darah vena diambil dari pesakit ke dalam tiub ujian steril dengan larutan antikoagulan (heparin). Kemudian leukosit dipisahkan dan diproses mengikut langkah di atas.

Peringkat seterusnya menyediakan bahan untuk penyelidikan ialah "memotong" DNA menjadi serpihan di kawasan dengan urutan asas yang ketat, yang dijalankan menggunakan enzim bakteria - endonucleases sekatan (enzim sekatan). Enzim sekatan mengiktiraf jujukan khusus 4-6, kurang kerap 8-12 nukleotida dalam molekul DNA untai dua dan membahagikannya kepada serpihan di lokasi jujukan ini, dipanggil tapak sekatan. Bilangan serpihan sekatan DNA yang terhasil ditentukan oleh kekerapan berlakunya tapak sekatan, dan saiz serpihan ditentukan oleh sifat pengedaran tapak ini sepanjang panjang molekul DNA asal. Lebih kerap tapak sekatan terletak, lebih pendek serpihan DNA selepas sekatan. Pada masa ini, lebih daripada 500 jenis enzim sekatan yang berbeza dari asal bakteria diketahui, dan setiap enzim ini mengiktiraf urutan nukleotida spesifiknya sendiri. Pada masa hadapan, tapak sekatan boleh digunakan sebagai penanda genetik DNA. Serpihan DNA yang terbentuk akibat sekatan boleh dipesan mengikut panjang melalui elektroforesis dalam gel agarose atau poliakrilamida, dan dengan itu berat molekulnya boleh ditentukan. Biasanya, DNA dalam gel dikenal pasti melalui pewarnaan khusus (biasanya etidium bromida) dan melihat gel dalam cahaya ultraviolet yang dihantar. Tapak penyetempatan DNA berwarna merah. Walau bagaimanapun, pada manusia, apabila DNA diproses oleh beberapa enzim sekatan, begitu banyak serpihan dengan panjang yang berbeza terbentuk sehingga ia tidak dapat dipisahkan oleh elektroforesis, iaitu tidak mungkin untuk mengenal pasti secara visual serpihan DNA individu pada elektroforesis (pewarnaan seragam diperoleh sepanjang keseluruhan gel). Oleh itu, untuk mengenal pasti serpihan DNA yang dikehendaki dalam gel sedemikian, kaedah hibridisasi dengan probe DNA berlabel digunakan.

Mana-mana segmen untaian tunggal DNA atau RNA mampu mengikat (menghibridisasi) dengan untaian pelengkap, dengan guanin sentiasa mengikat sitosin, dan adenin kepada timin. Ini adalah bagaimana molekul untai dua terbentuk. Jika salinan terkandas tunggal gen klon dilabelkan dengan label radioaktif, siasatan diperolehi. Siasatan itu mampu mencari segmen pelengkap DNA, yang kemudiannya mudah dikenal pasti menggunakan autoradiografi. Siasatan radioaktif yang ditambahkan pada penyediaan kromosom yang diregangkan membolehkan gen disetempatkan pada kromosom tertentu: menggunakan siasatan DNA, kawasan tertentu boleh dikenal pasti semasa penyekatan Selatan. Hibridisasi berlaku jika bahagian DNA yang diuji mengandungi gen normal. Dalam kes di mana jujukan nukleotida yang tidak normal hadir, iaitu struktur kromosom yang sepadan mengandungi gen mutan, hibridisasi tidak akan berlaku, yang membolehkan penyetempatan gen patologi ditentukan.

Untuk mendapatkan probe DNA, kaedah pengklonan gen digunakan. Intipati kaedah ini ialah serpihan DNA yang sepadan dengan gen atau bahagian gen dimasukkan ke dalam zarah pengklonan, biasanya plasmid bakteria (DNA ekstrachromosomal anulus terdapat dalam sel bakteria dan membawa gen rintangan antibiotik), dan kemudian bakteria dengan plasmid dengan gen manusia yang dimasukkan didarabkan. Terima kasih kepada proses sintesis dalam plasmid, berbilion salinan gen manusia atau bahagiannya boleh diperolehi.

Salinan DNA yang terhasil, dilabelkan dengan label radioaktif atau fluorochromes, kemudian digunakan sebagai probe untuk mencari urutan pelengkap di antara kumpulan molekul DNA yang dikaji.

Pada masa ini, terdapat pelbagai jenis kaedah menggunakan probe DNA untuk mendiagnosis mutasi gen.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]