Kaedah genetik molekul untuk diagnosis penyakit keturunan

Kaedah teknologi DNA digunakan untuk menentukan lokalisasi dalam kromosom tertentu gen mutant yang bertanggungjawab untuk asal-usul bentuk patologi keturunan tertentu. Sejak gen adalah segmen DNA dan gen mutasi - kerosakan kepada struktur utama DNA (mutasi yang difahami oleh semua perubahan dalam urutan DNA, tanpa mengira lokasi mereka dan pengaruh ke atas daya maju individu) penyakit kemudian menyelesaikan sesuatu persediaan kromosom pesakit metafasa diwarisi, mungkin untuk menubuhkan penyetempatan gen patologi. Kaedah genetik molekul mewujudkan peluang untuk mendiagnosis penyakit pada tahap struktur DNA yang diubah, mereka membenarkan untuk mengetahui penyetempatan gangguan keturunan. Kaedah genetik molekul boleh mendedahkan mutasi yang berkaitan dengan penggantian bahkan satu pangkalan.

Peringkat yang paling penting dalam mengenal pasti gen adalah pengasingannya. DNA boleh diasingkan dari sebarang jenis tisu dan sel yang mengandungi nukleus. Langkah-langkah pengasingan DNA termasuk lysis pesat sel-sel oleh pengemparan dengan penyingkiran serpihan organel sel dan membran, kemusnahan enzim protein dan pengeluaran mereka dari penyelesaian dengan fenol dan kloroform, kepekatan DNA oleh hujan dalam etanol.

Dalam makmal genetik, DNA paling sering diasingkan daripada leukosit darah, yang mana pesakit diambil 5-20 ml darah vena dalam tiub steril dengan larutan antikoagulan (heparin). Leukosit kemudian dipisahkan dan diproses mengikut langkah-langkah yang digariskan di atas.

Peringkat seterusnya penyediaan bahan untuk kajian - DNA "cut" kepada serpihan di laman web dengan urutan asas ketat tertentu dilakukan melalui enzim bakteria - endonucleases sekatan (enzim sekatan). Enzim sekatan mengiktiraf urutan tertentu 4-6, sekurang-kurangnya 8-12 nukleotida ke dalam molekul DNA dua terkandas dan dipisahkan ke dalam serpihan urutan ini menyetempatkan laman yang dikenali sebagai laman sekatan. Bilangan serahan DNA sekatan yang dihasilkan ditentukan oleh kekerapan tapak sekatan, dan saiz serpihan ditentukan oleh pengedaran tapak-tapak ini sepanjang panjang molekul DNA asal. Selalunya laman sekatan terletak, lebih pendek serpihan DNA selepas sekatan. Pada masa ini, lebih daripada 500 jenis enzim pembezaan jenis bakteria diketahui, dan setiap enzim ini mengiktiraf urutan nukleotida spesifiknya. Di masa depan, tapak sekatan boleh digunakan sebagai penanda genetik untuk DNA. Serpihan DNA yang terbentuk akibat daripada sekatan boleh dipesan sepanjang panjang oleh elektroforesis dalam gel agarose atau polyacrylamide, dan oleh itu berat molekul mereka boleh ditentukan. Biasanya untuk mengesan DNA dalam gel yang digunakan oleh pewarnaan tertentu (biasanya ethidium bromida) dan melihat gel dalam dipancarkan cahaya ultraungu. Lokasi penyetempatan DNA mempunyai warna merah. Walau bagaimanapun, seseorang dalam pemprosesan beberapa sekatan DNA endonucleases membentuk begitu banyak serpihan panjang yang berbeza bahawa mereka gagal untuk dipisahkan oleh elektroforesis, ia tidak mungkin untuk visual mengenal pasti serpihan DNA individu untuk electrophoregram (yang dihasilkan warna seragam di seluruh panjang gel). Oleh itu, kaedah hibridisasi dengan probe DNA berlabel digunakan untuk mengenal pasti serpihan DNA yang dikehendaki dalam gel tersebut.

Sebarang segmen tunggal DNA atau RNA dapat mengikat (hibrid) ke rantai pelengkapnya, dan guanine sentiasa dikaitkan dengan sitosin, adenin dengan timin. Ini adalah pembentukan molekul dua stranding. Jika satu salinan terkandas dari gen diklon dilabelkan dengan label radioaktif, siasatan akan diperolehi. Siasatan itu dapat mencari segmen DNA pelengkap, yang kemudiannya mudah dikenalpasti oleh radioautografi. Siasatan radioaktif yang ditambahkan kepada ubat kromosom yang diregangkan membolehkan gen tersebut disetempat pada kromosom tertentu: sampel DNA tertentu dapat dikenal pasti dengan penyelidikan DNA di Southern blotting. Hibridisasi berlaku jika bahagian ujian DNA mengandungi gen biasa. Dalam kes di mana terdapat urutan normal nukleotida, iaitu struktur kromosom yang sepadan mengandungi gen mutan, penghibridan tidak akan berlaku, yang membolehkan untuk menentukan penyetempatan gen tidak normal.

Untuk mendapatkan probe DNA, kaedah pengklonan gen digunakan. Intipati kaedah yang terdiri dalam yang serpihan DNA yang sepadan dengan mana-mana gen atau rantau gen yang dimasukkan ke dalam zarah pengklonan, biasanya plasmid bakteria (pekeliling extrachromosomal DNA di dalam sel-sel bakteria dan membawa gen rintangan kepada antibiotik), dan kemudian bakteria mempunyai plasmid dengan genom manusia yang bersepadu, dibiakkan. Oleh kerana proses sintesis ia adalah mungkin untuk mendapatkan berbilion plasmid salinan gen manusia atau sebahagian daripadanya.

Selanjutnya, salinan DNA yang dilabelkan dengan label radioaktif atau fluorochromes digunakan sebagai probe untuk mencari urutan pelengkap di antara kumpulan molekul DNA yang dikaji.

Pada masa ini, terdapat banyak jenis kaedah yang menggunakan probe DNA untuk diagnosis mutasi gen.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],